Aneuploidiediagnostik mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH); Stellenwert bei Schwangerschaften mit erhöhtem Risiko für Chromosomenaberrationen[*]

 

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Zusammenfassung

Fragestellung Bei ultrasonographisch auffälligem Fetus, bei einem positiven Serum-Screening-Ergebnis und bei Altersrisiko für eine fetale Aneuploidie bei fortgeschrittener Schwangerschaftswoche kann die Abklärung des fetalen Karyotyps von entscheidender Bedeutung für das weitere Vorgehen sein. Mit der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) an Interphasekernen von unkultivierten Amnionzellen ist eine Detektion der häufigsten Aneuploidien, die ca. zwei Drittel aller Chromosomenaberrationen ausmachen [1], innerhalb von 24 Stunden möglich.

Wir untersuchten die Frage, ob der Einsatz der FISH-Technik in Kombination mit der Karyotypisierung nach Zellkultur andere Methoden der schnellen Aneuploidiediagnostik wie die Karyotypisierung aus fetalem Blut oder Plazentagewebe ersetzen kann.

Material und Methodik Für diese inzwischen „Schnelltest” genannte Untersuchung wurden an 230 Fruchtwasserproben direkt mit Fluorochromen markierte DNA-Proben der Firma Vysis (Stuttgart) verwendet. Die Methodik wurde parallel zur herkömmlichen Zytogenetik an Fruchtwasserproben aus Schwangerschaften mit einem erhöhten Risiko für fetale Chromosomenaberrationen eingesetzt.

Es wurde dabei eine Optimierung sowohl der Präparationsmethode der Zellen als auch die Handhabung der DNS-Proben bezüglich Denaturierung, Hybridisierungsbedingungen und Stringenz für unsere Laborbedingungen angestrebt.

Ergebnisse Alle Fälle mit Trisomie 21, 18 und 13 sowie Aneuploidien der Geschlechtschromosomen, die mit der Zytogenetik nachgewiesen wurden (n=34), wurden auch durch die FISH-Analytik erkannt mit Ausnahme einer Mosaiktrisomie 21, die aufgrund technischen Versagens nur über die Karyotypisierung erkannt wurde. Nach Zellkultivierung wurden weitere 6 Chromosomenaberrationen (fetale Mosaike und chromosomale Strukturaberrationen) festgestellt, die naturgemäß mit dem FISH-Testsystem nicht nachgewiesen werden können. Der Anteil an Zellkernen mit aberranter Signalkonstellation lag bei den Fällen mit nachgewiesener Aneuploidie bei durchschnittlich 89 %. Mehr als 50 Zellkerne konnten mit der FISH-Methode in 86 % der Fruchtwasserproben untersucht werden. Wegen zu weniger Zellkerne mit Hybridisierungssignalen (< 15) oder wegen technischen Versagens gab es insgesamt 12 nicht informative Fälle. 17,4 % der untersuchten Fruchtwasserproben wiesen eine Kontamination mit mütterlichen Zellen auf.

Schlussfolgerung Der Einsatz von Methoden, die innerhalb kürzester Zeit eine Chromosomenanalyse ermöglichen, ist in den Fällen, in denen ein hohes Risiko für eine fetale Chromosomenanomalie vorliegt und eine rasche klinische Entscheidung in Abhängigkeit vom fetalen Karyotyp getroffen werden muss, einer Amniozentese und einer Aneuploidiediagnostik mittels FISH vorzuziehen,

- da chromosomale Mosaike und Strukturaberrationen, die in diesem Kollektiv einen erheblichen Teil der Chromosomenaberrationen ausmachen, mit diesem Testsystem nicht erkannt werden können,

- nicht informative Befunde in bis zu 15 % der untersuchten Proben auftreten können und

- das Ergebnis der FISH-Diagnostik durch die Kontamination der Proben mit mütterlichen Zellen verfälscht werden kann.

In all diesen Situationen muss auf das Ergebnis der Karyotypisierung nach Zellkultivierung gewartet und damit eine Verzögerung der Diagnostik gegenüber alternativen Methoden der schnellen Karyotypisierung aus fetalem Blut und Plazentagewebe in Kauf genommen werden.

Background In the case of abnormal ultrasound findings, abnormal serum-screening and age-risk in advanced pregnancy a rapid diagnosis or exclusion of a chromosomal aneuploidy of the fetus is of great value for the clinical management. With fluorescence in situ hybridization (FISH) on uncultured amniotic fluid cells the detection of the most common aneuploidies, which account for about ⅔ of all chromosomal aberrations [1], is possible within 24 hours.

The aim was to evaluate if the FISH-technique in combination with karyotyping after cell culturing could replace other methods like diagnostics from umbilical cord blood or placental biopsies.

Materials and methods For the FISH assays commercially available directly with fluorochromes labelled DNA-probes (Vysis, Stuttgart) were used. FISH assays were performed on amniotic fluid samples from pregnancies at risk for fetal chromosome aberrations parallel to standard cytogenetic analysis.The method was performed on 230 samples of amniotic fluid. We tried to optimize the method concerning preparation of the cell material, the denaturation- and hybridization-steps as well as stringency of post-hybridization washes.

Results All trisomies 13, 18, 21 and the sex chromosome aneuploidies (n=34) which were diagnosed by conventional cytogenetics were identified correctly by FISH analysis with the exception of one case of trisomy 21 mosaicism, in which hybridization failed. As structural chromosome aberrations and mosaicisms cannot be detected with this method, six additional chromosome aberrations were identified exclusively by cytogenetic analysis. The mean frequency of nuclei with abnormal signal pattern in the aneuploid cases was 89 %. A minimum of 50 nuclei for each DNA-probe could be counted in 86 % of the samples. The results of 12 cases were classified as uninformative, because only less than 15 hybridized nuclei or no hybridization signals could be scored. Maternal contamination was found in 17,4 % of the samples.

Conclusions In clinical cases with a high risk for an abnormal fetal karyotype and the need of quick clinical consequences, methods which make possible a karyotyping within shortest time should be preferred to amniocentesis and FISH-analysis, because

- Chromosomal mosaicism and structural aberrations, which represent up to 20 % of all chromosomal abnormalities in this group, cannot be detected,

- uninformative cases can occur in up to 15 % of all investi- gated samples and

- There is a risk for false-negative results through contamina- tion of the sample with cells of maternal origin.

In comparison with methods which permit rapid karyotyping from umbilical cord blood or placental biopsies, a delay in the diagnostic procedure has to be accepted, when the result of the FISH-analysis has to be confirmed by cell culturing and standard cytogenetic analysis.

1 Eingang: 17. 9. 1998Angenommen: 17. 2. 1999

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1 Eingang: 17. 9. 1998Angenommen: 17. 2. 1999

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Renate Ulmer

Institut für Humangenetik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

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