16S mtDNA variation in Apis mellifera detected by PCR-RFLP

Abstract

Phylogeographic and morphometric evidence can be used to cluster Apis mellifera subspecies into evolutionary lineages or branches. Mitochondrial DNA sequence and restriction site analyses have shown similar clustering of subspecies groups. Thus, mtDNA variation can be used to infer honey bee evolutionary relationships. In this paper, we describe three 16S mtDNA PCR-RFLP patterns, each one completely associated with a previously determined A, M, or C Dra I restriction pattern of the COI-COII region. These results indicate that the COI-COII and the 16S genes have had a very closely linked evolutionary history. Although distinct patterns were obtained with Eco RI, Alu I, Hinc II and Taq I, the best differentiation among the three patterns was observed with Dra I and Vsp I enzymes. Nucleotide sequence analysis of the16S gene fragment displayed 10 sites of base substitution (1.35%) among the three patterns and two insertions in the A. m. scutellata pattern.

Zusammenfassung

Ähnlich wie phylogeographische und morphometrische Evidenzen können auch Daten zu Variationen in der mitochondrialen DNA (mtDNA) herangezogen werden, um Schlüsse hinsichtlich evolutiver Beziehungen zu ziehen. Der Verdau der mitochondrialen intergenen COI-COII Region mittels DraI (Garnery et al., 1993) stellt gegenwärtig die Methode mit der besten Auflösung für die Charakterisierung und Zuordnung von Subspezies zu mitochondialen Linien dar. Populationsanalysen mittels mtDNA-Polymorphismen können dementsprechend ein wertvolles Werkzeug darstellen, um Richtungen und Mechanismen in der mtDNA-Genomevolution zu untersuchen. Als Teil einer Suche nach neuer mtDNA Variabilität beschreibt diese Studie die Amplifikations- und Restriktionsmuster für eine weitere mitochondriale DNA Region (16S) in Proben, die zuvor hinsichtlich ihrer COI-COII-Muster als A, M oder C klassifiziert wurden. Insgesamt wurden Proben von 38 Völkern mit M-Muster, 89 mit dem C- und 232 mit dem A-Muster gewonnen. Die Orte der Probennahmen und die jeweilige Zahl der untersuchten Völkern sind in Tabelle I zusammengestellt. DNA wurde individuell mittels Phenol-Chloroform aus Thoraxstücken extrahiert. Die DNA-Fraktion wurde für die PCR-Amplifizierung des 16S Locus verwendet und anschliessend mittels der folgenden Enzyme verdaut: Hinc II, Vsp I, Alu I, Taq I, Eco RI und Dra I.Die amplifizierten Fragmente und die Produkte der Endonukleasenverdaue wurden in 8 %, bzw. 10 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Restriktionsanalysen der mitochondrialen DNA der Cytochrom b (Bgl II), COI (Hinc II) und COI-COII (Dra I) Regionen wurden für eine vergleichende molekulare Charakterisierung der Honigbienenproben durchgeführt. Anhand der 16S Amplifizierung und der Restriktionsanalyse wurden drei Muster festgestellt, die entsprechend ihrer assoziierten COI-COII-Muster als A, M und C bezeichnet wurden (Abb. 2). Das amplifizierte 16S-Genfragment wies in den C- und M-Proben eine Grösse von 740 bp und in den A-Proben eine Grösse von 742 bp auf. Paarweise oder multiple Vergleiche der DNA-Sequenzen zeigten Nukleotidsubstitutionen an 10 Positionen (1,35 %) (Abb. 1). Das gemeinsame Vorkommen der M- und A-Muster in Spanien belegt die Ergebnisse früherer Studien und weist darauf hin, dass dieses Land eine sekundäre Kotaktzone zwischen diesen beiden Linien darstellt. In der vorliegenden Studie zeigten 17 von 44 Völkern aus Italien das M-Muster und eines das A-Muster. Dieses Ergebnis bestätigt frühere Analysen, die zeigten, dass italienische Honigbienenpopulationen aus den M- und C-Linien der mitochondrialen DNA zusammengesetzt sind. Obwohl mittels Eco RI, Alu I, Hinc II und Taq I-Verdau gut unterscheidbare Muster erzeugt werden konnten, war die klarste Differenzierung für die drei Haplotypen bei Dra I und VspI I-Verdauen zu beobachten. Die 16S mtDNA Variation kann nicht nur eine alternative Methode für die Identifizierung der maternalen DNA-Abstammung eines Volkes darstellen, vielmehr kann der in dieser Arbeit aufgezeigte Polymorphismus, zusammen mit anderen Polymorphismen, sich auch als nützlich erweisen, um Ereignisse der mtDNA-Evolution bei A. mellifera zu untersuchen