Elsevier

Biochimie

Volume 68, Issue 1, January 1986, Pages 25-34
Biochimie

Purification to homogeneity of Azotobacter vinelandii hydrogenase: a nickel and iron containing αβ dimer

https://doi.org/10.1016/S0300-9084(86)81064-1Get rights and content

Summary

Azotobacter vinelandii hydrogenase has been purified to homogeneity from membranes. The enzyme was solubilized with Triton X-100 followed by ammonium sulfate-hexane extractions to remove lipids and detergent. The enzyme was then purified by carboxymethyl-sepharose and octyl-Sepharose column chromatography. All purification steps were performed under anaerobic conditions in the presence of dithionite and dithiothreitol. The enzyme was purified 143-fold from membranes to a specific activity of 124 μmol of H2 uptake·min−1·mg protein−1. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of the hydrogenase revealed a single band which stained from both activity and protein. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis revealed two bands corresponding to peptides of 67,000 and 31,000 daltons. Densitometric scans of the SDS-gel indicated a molar ratio of the two bands of 1.07±0.05. The molecular weight of the native enzyme was determined by three different methods. While gel permeation gave a molecular weight of 53,000, sucrose density gradient centrifugation and native polyacrylamide gel electrophoresis gave molecular weights of 98,600±10,000 and 98,600±2,000, respectively. We conclude that the A. vinelandii hydrogenase is an αβ dimer (98,000 daltons) with subunits of 67,000 and 31,000 daltons. Analyses for nickel and iron indicated 0.68±0.01 mol Ni/mol hydrogenase and 6.6±0.5 mol Fe/mol hydrogenase. The isoelectric point of the enzyme was 6.1±0.1. In addition, several catalytic properties of the enzyme have been examined. The Km for H2 was 0.86 μM, and H2 evolution was observed in the presence of reduced methyl viologen. The pH profile of enzyme activity with methylene blue as the electron acceptor has been determined, along with the Km and Vmax for various electron acceptors.

Résumé

L'hydrogénase d'Azotobacter vinelandii a été purifiée à partir des membranes jusqu'à homogénéité. L'enzyme a été solubilisé par le Triton X-100 suivi d'extractions successives par l'hexane et le sulfate d'ammonium afin d'enlever les lipides et le détergent. L'enzyme a ensuite été purifiée par chromatographie sur colonne de carboxyméthyl-Sépharose et d'octyl-Sépharose. Toutes les étapes de purification ont été effectuées dans des conditions anaérobiques en présence de dithionite et de dithiothreitol. L'enzyme a été purifiée 143 fois à partir des membranes, jusqu'à une activité spécifique de 124 μmol dè consommation de H2·min−1·mg protéine−1. Une électrophorèse non dénaturante de l'hydrogénase sur gel de polyacrylamide a révélé une seule bande se colorant et pour l'activité et pour la protéine. Une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS révèle deux bandes correspondant à des peptides de 67 000 et 31 000 daltons. Des examens densitométriques du gel-SDS ont indiqué un rapport molaire des deux bandes de 1,07±0,05. Le poids moléculaire de l'enzyme native a été déterminé par trois méthodes différentes. Alors que la chromatographie sur tamis moléculaire donne un poids moléculaire de 53 000, la centrifugation en gradient de densité de saccharose et l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturante donnent des poids moléculaires de 98 600±10 000 et 98 600±2 000, respectivement. Nous en concluons que l'hydrogénase d'A. vinelandii est un dimère αβ (98 000 daltons) avec des sous-unités de 67 000 et 31 000 daltons. Les analyses de la teneur en nickel et en fer indiquent 0,68±0,01 mol Ni/mol hydrogénase et 6,6±0,5 mol Fe/mol hydrogénase. Le point isoélectrique de l'enzyme est 6,1±0,1. En outre, nous avons examiné plusieurs propriétés catalytiques de l'enzyme. Le Km pour H2 est 0,86 μM et l'évolution de H2 est observée en présence de méthyl viologène réduit. Nous avons déterminé le profil de l'activité enzymatique en fonction du pH avec du bleu de méthylène comme accepteur d'électrons, ainsi que le Km et le Vmax pour divers accepteurs d'électrons.

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