Introduzione

Le iperplasie surrenaliche bilaterali sono una delle cause di ipercortisolemia endogena cronica associate alla sindrome di Cushing (Figura 1) e, in base alla dimensione della lesione, vengono suddivise in forme micro- (PPNAD e iMAD) e macronodulari (PBMAH).

Fig. 1
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Classificazione dei tumori corticosurrenalici

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Negli ultimi anni sono stati compiuti numerosi passi in avanti nella comprensione delle cause genetiche e molecolari di queste diverse forme di iperplasia (Figura 2). Fra queste, di primaria importanza sono quelle che coinvolgono le mutazioni e la disregolazione di effettori/modulatori della via cAMP/protein chinasi A (PKA). Il signalling della PKA, infatti, rappresenta il pathway molecolare principale che controlla la secrezione di cortisolo nelle cellule corticosurrenali, mediato dall’ACTH. Sebbene le mutazioni della subunità regolatoria R1\(\alpha \) della PKA rappresentino la causa principale di PPNAD familiare e sporadica, l’inattivazione di due fosfodiesterasi, PDE11A e PDE8B, è stata associata a iMAD, ma anche ad alcuni casi di PPNAD e PBMAH. È interessante notare che la PBMAH osservata in sindromi familiari, quali FAP, MEN1 e HLRCC, è stata inizialmente associata all’espressione aberrante dei recettori accoppiati a proteine G con conseguente attivazione della via cAMP/PKA. La recente scoperta dell’associazione fra mutazioni germinali nel gene KDM1A e ARMC5 ha dato un definitivo slancio all’importanza della componente ereditaria nella PBMAH.

Fig. 2
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Azione dell’ACTH nella sintesi del cortisolo e principali alterazioni genetiche coinvolte nell’insorgenza di iperplasie macro/micronodulari corticosurrenaliche. \(Gs\), proteina G stimolatoria; PDE, fosfodiestarsi; \(L\), ligando di GPCR; \(AC\), adenilato ciclasi

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Iperplasia surrenalica micronodulare bilaterale (MiAH)

Le iperplasie surrenaliche micronodulari sono una forma rara di iperfunzionalità corticosurrenalica definite dalla presenza di noduli di diametro <10 mm. Le due forme principali di MiAH, l’iperplasia surrenalica primitiva nodulare pigmentata (PPNAD) e la malattia adrenocorticale micronodulare isolata (iMAD), si distinguono in base allo stato della corteccia surrenalica circostante la lesione, il cosiddetto tessuto internodulare, e alla presenza o meno di pigmentazione. Il tessuto corticosurrenale internodulare può, infatti, essere iperplastico oppure atrofico, per ragioni tuttavia ancora poco chiare. La pigmentazione macroscopica che può caratterizzare queste lesioni è dovuta a deposizioni subcellulari di granuli di lipofuscina, composti da residui non degradabili dell’ossidazione di lipidi e proteine.

Sebbene entrambe possano presentarsi in forma isolata, sia sporadica che familiare, quella più comune è la PPNAD familiare, come parte del complesso di Carney (CNC).

PPNAD

La PPNAD è una forma rara di ipercortisolismo ACTH-indipendente caratterizzata da surreni di dimensioni normali o ingranditi con micronoduli bilaterali pigmentati e tessuto internodulare atrofico. Presente in forma sporadica, nella maggior parte dei casi (∼60%) la PPNAD è la principale manifestazione endocrina di CNC, una sindrome caratterizzata da neoplasie multiple, un’anomala pigmentazione cutanea e mucosa e mixomi cutanei e cardiaci [1]. In ∼70% dei casi il CNC è trasmesso come un carattere autosomico dominante a penetranza pressoché completa. Nel rimanente 30% CNC si manifesta in forma sporadica, spesso come conseguenza di mutazioni de novo. È presente un certo grado di eterogeneità genetica, con due loci genici associati alla malattia: il 2p16 e il 17q22-24. Quest’ultimo include il gene PRKAR1A mutato in circa tre quarti dei pazienti CNC. L’aploinsufficienza che ne consegue, rimuovendo un modulatore dell’attività catalitica di PKA, attiva costitutivamente la via cAMP/PKA nei tessuti bersaglio.

Il ruolo essenziale di PRKAR1A nella differenziazione e nell’omeostasi del corticosurrene, così come gli effetti della sua perdita nel riprodurre molte delle caratteristiche della PPNAD, è stato dimostrato grazie a un modello murino knockout condizionale surrenalico (AdKO) [2] – la deplezione completa di Prkar1a è infatti letale in utero. Come nei pazienti PPNAD, le femmine AdKO sviluppano un CS ACTH-indipendente, con alcune analogie fenotipiche. La perdita dell’effetto regolativo di Prkar1a su PKA nel surrene di questi animali stimola l’attività di PKA, la sovraregolazione degli enzimi steroidogenici e l’ipersecrezione di corticosterone – l’equivalente murino del cortisolo umano. Inoltre, mentre non si osservano effetti sulla massa surrenalica, l’inattivazione di Prkar1a, porta a un drastico cambiamento istologico e differenziativo [2].

La caratterizzazione degli animali AdKO ha inoltre fornito informazioni sul meccanismo tumorigenico associato all’inattivazione di PRKAR1A. Nelle cellule corticosurrenali umane e murine, l’aumentata attività di PKA si traduce in una maggiore resistenza all’apoptosi, contribuendo di fatto al processo tumorigenico. Negli animali AdKO questa resistenza è associata a una maggior attivazione della via mTOR con conseguente fosforilazione dei suoi bersagli, inclusa la proteina proapoptotica BAD che viene così inibita. In questi modelli, l’inibizione di mTORC1 mediante trattamento con rapamicina ripristina la sensibilità delle cellule corticosurrenali all’apoptosi, suggerendo che mTOR potrebbe rappresentare un possibile bersaglio terapeutico nella PPNAD.

iMAD

A differenza di PPNAD, l’iMAD è caratterizzata da surreni quasi completamente privi di pigmentazione e un’iperplasia del tessuto internodulare [3]. Nella patogenesi dell’iMAD il ruolo principale è svolto delle fosfodiesterasi (PDE). La combinazione di genome wide SNP genotyping con il clonaggio funzionale ha permesso di identificare mutazioni inattivanti in PDE11A in tre famiglie [4]. Nonostante la doppia specificità di substrato (PDE11A può idrolizzare sia cAMP che cGMP) nel contesto delle cellule corticosurrenali, si può facilmente ipotizzare che il principale effetto patogeno legato all’inattivazione di PDE11A coinvolga il cAMP, con un’attivazione anomala della via cAMP/PKA. Questa ipotesi è supportata dall’osservazione che l’inibizione di PDE11 nella linea adrenocorticale umana H295R porta all’aumento dei livelli di cAMP e cortisolo. Ma l’associazione delle PDE all’iMAD è stata confermata dalle evidenze emerse a carico della PDE8B, una PDE cAMP specifica e fortemente espressa nel corticosurrene per la quale mutazioni germinali sono state descritte in almeno una paziente con CS e iMAD [4].

Ma il coinvolgimento delle PDE nei disturbi surrenalici non si limita a questa forma di iperplasia bilaterale. Mutazioni inattivanti in PDE11 e PDE8B sono state, infatti, riportate anche in PPNAD e PBMAH, in accordo con il fatto che alterazioni della via cAMP/PKA accomunano questi disturbi. È interessante notare che un numero significativamente maggiore di PPNAD è stato riportato in pazienti CNC con mutazioni PRKAR1A in presenza di varianti in PDE11A. Questo suggerisce che in questo contesto alterazioni in PDE11A (ma potrebbe valere anche per PDE8B) possano rappresentare un evento secondario che contribuisce all’attivazione della via cAMP/PKA e, di conseguenza, all’ipercortisolismo [3].

Va infine sottolineato che le mutazioni nelle PDE spiegano solo una parte degli iMAD. Sebbene le cause genetiche associate agli altri casi rimangano da chiarire, l’ampia eterogeneità istologica che si rileva nelle iMAD suggerisce il coinvolgimento di mutazioni a carico di geni che interessano diversi regolatori della via cAMP/PKA.

Iperplasia surrenalica macro-nodulare bilaterale primaria (PBMAH)

La PBMAH – già definita come malattia adrenocorticale macronodulare massiccia (MMAD), iperplasia surrenalica macronodulare primaria (PMAH), iperplasia surrenalica macronodulare ACTH-indipendente (AIMAH) o iperplasia macronodulare bilaterale – è una rara causa di CS caratterizzata dalla presenza di macronoduli con un diametro >10 mm. Essa può presentarsi in maniera sporadica oppure in forma ereditaria con trasmissione autosomica dominante. Molto raramente la malattia si inserisce nel contesto di sindromi tumorali (vedi sotto).

Generalmente viene diagnosticata nella sesta decade di vita e, come per altre forme di CS, la PBMAH ha una maggior prevalenza nelle donne [5, 6]. Anche se sono state riportate forme gravi, la CS osservata nei pazienti con PBMAH è spesso più lieve rispetto a quella osservata in altri tumori o iperplasie del corticosurrene e viene spesso scoperta come incidentaloma surrenalico [5]. Questo rende, pertanto, complesso definirne accuratamente la prevalenza nella popolazione generale.

Sebbene alterazioni della via cAMP/PKA siano state riportate [7], l’alterazione molecolare più comune nelle lesioni dei pazienti PBMAH è l’espressione aberrante dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) [8]. L’espressione ectopica o eutopica di GPCR mima, in risposta a ormoni diversi dall’ACTH, la risposta cellulare solitamente innescata dall’attivazione di MC2R. Questo porta all’attivazione della via cAMP/PKA e conseguente stimolazione della steroidogenesi [8]. I GPCR espressi in maniera ectopica includono quelli per il peptide insulinotropico glucosio-dipendente (GIPR), i recettori b-adrenergici (ADRB), quelli per la vasopressina (AVPR2, AVPR3), la serotonina (HTR7), il glucagone (GCGR) e l’angiotensina II (AT1R). In altri casi, l’iperfunzionalità surrenalica è garantita dall’espressione aumentata di recettori quali quelli per la vasopressina (AVPR1), l’ormone luteinizzante/gonadotropina corionica umana (LHCGR) o la serotonina (HTR4) [8]. L’uso in vivo di test dinamici selettivi può consentire di chiarire se e quali recettori siano coinvolti nell’ipercortisolemia e indirizza, almeno in alcuni casi, la scelta terapeutica [9].

Sebbene l’espressione ectopica di GIPR sia stata associata alla microduplicazione del suo locus genico in un caso PBMAH, lavori recenti riconducono questo fenomeno a mutazioni germinali nel gene che codifica per la demetilasi istonica KDM1A [10, 11]. KDM1A è coinvolto nell’omeostasi genomica e nella regolazione dell’espressione genica e agisce a livello surrenalico come un oncosoppressore. La perdita di eterozigosità (LOH) nel locus 1p è stata, infatti, osservata nelle lesioni surrenaliche di pazienti PBMAH con mutazioni germinali in KDM1A. Studi funzionali basati su CRISPR-Cas9 hanno confermato un relazione diretta fra l’inattivazione di KDM1A e l’espressione differenziale di GIPR [10].

Con approcci simili, basati sulla genomica integrata, nel 2013 Assie e collaboratori hanno evidenziato l’associazione fra mutazioni germinali nel gene ARMC5 (ARMC5MUT) e la predisposizione allo sviluppo della PBMAH [12]. A differenza di altre sindromi tumorali (vedi sotto), dove l’associazione fra mutazioni germinali e PBMAH è valida in piccoli cluster di pazienti, ARMC5MUT sono state riportate nel 25–50% dei casi. Sebbene la sua funzione rimanga largamente sconosciuta, nel corticosurrene ARMC5 si comporta come un oncosoppressore, come conferma il fatto che mutazioni loss of function (LOF) sono presenti sia a livello germinale che somatico nello stesso soggetto. È interessante notare come noduli diversi dello stesso soggetto portino mutazioni somatiche diverse suggerendo che la presenza una mutazione germinale di ARMC5 possa aumentare l’instabilità del suo locus genico [3].

L’associazione fra ARMC5MUT e l’iperplasia surrenalica in pazienti PBMAH ha indotto a definire una forma familiare di PBMAH. In queste famiglie, lo screening molecolare può precedere la valutazione ormonale e l’imaging, limitandolo ai soli soggetti portatori di ARMC5MUT [13]. Nell’ambito di queste, la severità della CS può variare considerevolmente. Inoltre, dal confronto fra casi PBMAH con e senza ARMC5MUT, è emersa una maggior frequenza di CS conclamata e un’ipertensione più grave nel primo gruppo. Questo porta a concludere che il fenotipo più lieve osservato nell’ambito di famiglie PBMAH sia indice di una malattia ancora nelle sue fasi iniziali.

Studi in modelli nei quali ARMC5 è stato inattivato, ne suggeriscono un ruolo nel controllo della steroidogenesi corticosurrenale. Sorprendentemente, però, l’inattivazione di ARMC5 si associa a una diminuzione dell’espressione degli enzimi steroidogenici e dei livelli di glucocorticoidi. È stato inizialmente suggerito che l’inefficiente steroidogenesi che caratterizza ogni singola cellula potrebbe essere compensata dal considerevole aumento del loro numero nel macronodulo (dovuto anche allo stimolo pro-apoptotico normalmente esercitato da ARMC5) giustificando di fatto l’ipercortisolemia in questi soggetti. Nei modelli murini knockout per Armc5 (Armc5KO), tuttavia, un ipercorticosteronismo è presente in assenza di macronoduli. Rimane ancora da chiarire se questo sia riconducibile a differenze specie-specifiche, oppure a ulteriori meccanismi ancora sconosciuti che nel PBMAH potrebbero essere responsabili dello sviluppo dei macronoduli.

Infine, l’analisi di espressione in Armc5KO e nei soggetti affetti di una famiglia PBMAH ARMC5MUT ha evidenziato l’espressione aberrante di alcuni GPCR, inclusi il recettore alfa-2 adrenergico e il recettore 1a dell’arginina-vasopressina, suggerendo che l’inattivazione di ARMC5 possa giocare un ruolo in questo fenomeno caratteristico di PBMAH. Nessun caso di CS pasto-dipendente è stato tuttavia riportato in pazienti con ARMC5MUT, confermando che si tratta di un’entità clinica distinta la cui eziopatogenesi è direttamente legata alla presenza di mutazioni KDM1A.

Le recenti scoperte di mutazioni in KDM1A e ARMC5 associate al PBMAH ha palesato quello che per anni era stato ipotizzato sulla base della bilateralità delle lesioni e della presenza di rari casi familiari, cioè l’importanza della componente ereditaria. Questo è ulteriormente supportato dal fatto che la PBMAH può essere inclusa fra i segni clinici di alcune sindromi tumorali ereditarie, che saranno descritte nei prossimi paragrafi.

Poliposi adenomatosa familiare (FAP)

Mutazioni germinali in eterozigosi del gene APC provocano la FAP, una sindrome ereditaria caratterizzata dallo sviluppo di centinaia/migliaia di polipi adenomatosi colon-rettali che, se non trattati, presentano un rischio quasi certo di evoluzione in neoplasia maligna. I pazienti FAP, inoltre, presentano un rischio aumentato di adenoma, carcinoma del surrene e PBMAH. Questo è dovuto al ruolo che APC svolge nella regolazione della via Wnt/\(\beta \)-catenina. APC, che è coinvolto nel complesso di degradazione della \(\beta \)-catenina; una volta inattivato, induce l’accumulo nucleo-citoplasmatico di questo fattore co-trascrizionale, con conseguente attivazione del pathway Wnt/\(\beta \)-catenina. Il rescue genetico del fenotipo dovuto all’inattivazione casuale della \(\beta \)-catenina nelle lesioni corticosurrenali in topi ApcKO conferma il ruolo di \(\beta \)-catenina nel mediare l’effetto dell’inattivazione di Apc nella tumorigenesi corticosurrenale [14]. APC agisce come oncosoppressore anche nel surrene e, analogamente ad ARMC5, lesioni diverse in un paziente PBMAH presentano mutazioni somatiche diverse.

Neoplasia endocrina multipla di tipo 1 (MEN1)

La MEN1 è caratterizzata dalla presenza di tumori endocrini e non è causata da mutazioni inattivanti dell’oncosoppressore MEN1 che codifica per menina. La menina è una proteina scaffold che, interagendo con altre proteine, regola vari processi cellulari, fra cui l’espressione genica, la stabilità genomica e la trasduzione di segnali cellulari. L’aploinsufficienza di Men1 in modelli murini si associa allo sviluppo di adenomi delle paratiroidi, tumori ipofisari e del corticosurrene, caratteristiche simili alla sindrome umana [3].

La frequenza dei tumori corticosurrenali nei pazienti MEN1 può variare a seconda degli studi e delle tecniche di screening utilizzate. In uno studio retrospettivo, le lesioni surrenaliche si manifestano più precocemente nei pazienti MEN1 rispetto agli incidentalomi sporadici, supportandone il vincolo causale. Dei 715 pazienti inclusi in questo studio 146 presentavano surreni ingrossati. Nel 58,1% dei casi la lesione aveva dimensioni >10 mm e nel 12,5% dei casi era bilaterale [15], confermando il ruolo che l’inattivazione di MEN1 gioca nella determinazione fenotipica di PBMAH.

Leiomiomatosi ereditaria e carcinoma a cellule renali (HLRCC)

Mutazioni germinali in eterozigosi del gene fumarato idratasi (\(FH\)), coinvolto nella conversione del fumarato in malato, causano HLRCC. L’inattivazione biallelica di \(FH\) porta a un accumulo di fumarato nei mitocondri e nel citoplasma che, a cascata, provoca l’attivazione del fattore 1 indotto dall’ipossia (HIF1) inducendo un aumento dell’attività glicolitica, neovascolarizzazione e, più in generale, tumorigenesi. HLRCC è caratterizzato da leiomiosarcomi, leiomiomi cutanei e uterini e carcinomi renali papillari. In una coorte di 255 pazienti HLRCC, lesioni surrenaliche sono state riportate in 20 soggetti [16]. In quattro di questi le lesioni erano multifocali, in tre bilaterali. Questo dato suggerisce il possibile coinvolgimento di mutazioni LOF nella \(FH\) nello sviluppo della PBMAH. Ad oggi, mutazioni germinali di \(FH\) sono state descritte in pazienti HLRCC, ma mai a livello somatico.

Sindrome di McCune Albright (MAS)

La trasduzione del segnale extracellulare a livello dei GPCR (ad esempio MC2R nelle cellule corticosurrenali) si basa sulle proteine G eterotrimeriche, così definite perché costituite dalle tre subunità \(\alpha \), \(\beta \), \(\gamma \). La subunità \(\alpha \) è una GTPasi, che alterna uno stato attivo a uno inattivato a seconda che leghi GTP o GDP. Mutazioni post-zigotiche nel gene GNAS1 (il cosiddetto oncogene gsp), che codifica per la subunità \(\alpha \) della proteina G, in una distribuzione a mosaico provocano la MAS. Queste mutazioni, rimuovendo l’attività GTPasica, ne inducono l’attivazione costitutiva che porta a uno stimolo persistente verso l’adenilato ciclasi a produrre cAMP. La MAS è caratterizzata da una displasia ossea fibrosa poliostotica congenita, dalla presenza di macchie cutanee caffè-latte, pubertà precoce e da altri disturbi endocrini [1]. La PBMAH e, più in generale, CS è stata riportata in ∼7% dei casi di MAS [3], soprattutto in età pediatrica. Mutazioni somatiche sono state descritte anche nei noduli surrenalici di alcuni pazienti PBMAH, privi di altre manifestazioni associate a MAS [17, 18]. Gli effetti deleteri di queste rare mutazioni nella determinazione fenotipica di PBMAH sono naturalmente associati all’attivazione della via cAMP/PKA nelle cellule corticosurrenali, conseguente agli elevati livelli costituitivi di cAMP [19].

Mutazioni germinali nelle subunità catalitiche della PKA nelle iperplasie bilaterali cortisolo secernenti

Anche alterazioni nelle due subunità catalitiche di PKA sono state associate a processi di trasformazione neoplastica nella corticale del surrene. Mentre mutazioni somatiche inattivanti sono state riportate negli adenomi surrenalici monolaterali in pazienti CS, l’analisi array-CGH in 35 soggetti con BAH e CS florido ha rivelato in 5 di essi, appartenenti a 4 famiglie, l’amplificazione di una porzione del braccio corto del cromosoma 19, che comprende il gene PRKACA che codifica per la subunità catalitica A della PKA [3, 20]. Questa amplificazione germinale presente sempre in assenza di mutazioni nella sequenza codificante di PRKACA, negli unici due soggetti imparentati segregava con la malattia [16]. In tre di questi 5 soggetti il fenotipo istologico era paragonabile a quello del PPNAD, mentre negli altri due casi si trattava di un’iperplasia surrenalica diffusa con noduli. Questo, oltre a confermare che la stessa alterazione genetica può portare a fenotipi istologici diversi, suggerisce che differenze nel “dosaggio” funzionale di PRKACA, dovute all’amplificazione genica, possono avere effetti diversi sull’istologia della corteccia surrenale [21].

Discorso diverso vale per il gene che codifica per la subunità B della PKA (PRKACB). Aumenti del numero di copie del locus genico di PRKACB sono stati descritti in pazienti CNC, privi tuttavia di PPNAD [22]. Possibili varianti germinali di PRKACB sono state riportate in 2 soggetti con PPNAD e disturbi correlati privi di altri difetti connessi alla PKA. Il primo soggetto, caratterizzato da un fenotipo clinico piuttosto severo in particolare nello sviluppo scheletrico, presentava una mutazione LOF con evidenti effetti sulla stabilità proteica e con un’impropria attivazione del pathway della PKA. Il secondo, un paziente con PPNAD come unica manifestazione di CNC, presentava una variante missenso. Questa variante non alterava né la stabilità né la capacità della proteina di condurre il segnale lungo il pathway PKA/cAMP rimanendo, pertanto, una variante di significato incerto [23].

Conclusioni

Come riassunto in Tabella 1, negli ultimi anni numerosi progressi sono stati compiuti nella comprensione delle basi genetiche delle iperplasie surrenaliche bilaterali. Il ruolo di PRKAR1A e delle sue mutazioni nella PPNAD è ormai ben delineato, così come lo è quello delle PDE nella determinazione fenotipica dell’iMAD. Approcci di tipo pangenomico hanno consentito di chiarire vari aspetti dell’eziopatogenesi dell’iperplasia macronodulare e, grazie all’identificazione di mutazioni di ARMC5 e KDM1A, è oggi possibile eseguire screening familiari precoci per la diagnosi di CS, quando i rischi associati a una persistente ipercortisolemia possono ancora essere ridotti.

Tabella 1 Alterazioni genetiche nelle diverse forme di iperplasie surrenali bilaterali cortisolo-secernenti
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Rimangono, tuttavia, ancora alcuni aspetti da chiarire, comprese le cause dell’iMAD in assenza di mutazioni PDE e dell’iperplasia macronodulare bilaterale, dove, per una rilevante frazione di pazienti, manca ancora un chiaro meccanismo alla base della trasformazione neoplastica. Il recente coinvolgimento di KDM1A suggerisce che la componente epigenetica potrebbe avere un ruolo maggiore di quanto fino ad oggi considerato e un approfondimento di questo aspetto potrebbe fornire un importante contributo nella comprensione della sua eziopatogenesi.