Zusammenfassung
Mit harnstoffhaltigen Tris-Glycin-Puffer extrahierte Leguminosensamen-Proteine werden mit der hochauflösenden 2D-Elektrophorese (Harnstoff-IEF x Gradientengel-SDS-Elektrophorese) aufgetrennt, wobei beide Dimensionen in horizontalen ultradünnen, auf Folie polymerisierten Polyacrylamid-Flachgelen durchgeführt werden. Die Flachgel-Focussierung (1. Dimension) erlaubt die Trennung einer großen Anzahl von Proteinproben unter identischen Bedingungen, wodurch die Reproduzierbarkeit von 2D-Elektrophoresen erheblich verbessert wird. Das Gel der ersten Dimension (IEF) wird mit Coomassie BB G 250 gefdrbt, bevor die einzelnen Gelstreifen für die zweite Dimension (Gradientengel-SDS-Elektrophorese) verwendet werden. Dies hat den Vorteil, daß die focussierten Proteine bereits vor dem zweiten Trennungsschritt sichtbar gemacht und zudem die Trägerampholyte in der Farbstoff Front bei der SDS-Elektrophorese stark vermindert werden. Die vorgefärbten Focussierungsgele können problemlos in der Entfärbelösung für die SDS-Gradientengel-Elektrophorese aufbewahrt werden. Der Proteinverlust und die Banden-diffusion bei der SDS-Aquilibrierung werden durch die Fixierung im Focussierungsgel verhindert. Das 2-D-Proteinmuster wird durch das Vorfärben der focussierten Proteine nicht verdndert. Die dimensionsstabilen, auf Folie polymerisierten Focussierungsstreifen lassen sich einfach handhaben und müssen nicht wie Rundgele an die zweite Dimension aufpolymerisiert werden. Der Gel-Gel-Kontakt der beiden Flachgele ist ohne weitere Hilfsmaßnahmen ausgezeichnet.
Summary
Legume seed proteins extracted with urea-containing buffer are fractionated by high-resolution 2D-electrophoresis (urea-IEF x pore gradient SDS-PAGE), both dimensions in horizontal ultrathin-layer polyacrylamide gel slabs. High reproducibility is obtained, because the first dimension is performed in a slab gel, where a large number of protein samples are separated under identical conditions. The gel of the first dimension (IEF) is fixed, stained with Coomassie Brilliant Blue G 250, and destained before application to the second-dimension gel (SDS-PAGE). Prestaining of the focused proteins does not alter the protein pattern obtained after SDS electrophoresis. Thus, bands are made visible before separation in the second dimension, and the amount of Ampholine in the dye front is reduced during electrophoresis. The first-dimension gels can easily be stored in the destaining solution until they are run in the second dimension. As the proteins are fixed in the gel, there is no loss of proteins and defocusing of bands due to diffusion during the SDS-equilibration procedure. Loading of the dimensionstable gel strip onto the second dimension gel is a very easy operation, since the ultrathin gel strip adheres to a plastic foil and is simply laid into a moulded gel through. The gel strip is not imbedded with polymerizing acrylamide or agarose solution like in the conventional gel-rod-techniques, because a very good surface contact is obtained between the two flat gels.
References
Barrett T, Gould HJ (1973) Biochem Biophys Acta 294:165–170
McGilliwray AJ, Rickwood D (1974) Eur J Biochem 41:181–190
O'Farrell PH (1975) J Biol Chem 250:4007–4021
Anderson NG, Anderson NL (1978) Anal Biochem 85:331–341
Anderson NL, Anderson NG (1978) Anal Biochem 85:341–354
Görg A, Postel W, Westermeier R (1978) Anal Biochem 89:60–70
Görg A, Postel W, Westermeier R (1979) Z Lebensm Unters Forsch 168:25–28
Görg A, Postel W, Westermcier R (1979) GiT Labor-Medizin 2:32–40
Görg A, Postel W, Westermeier R (1980) Electrophoresis '79. Radola BJ (ed) W de Gruyter, Berlin New York, p. 67–78
Görg A, Postel W, Westermeier R (1980) Science Tools 27:14–18
Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG (1980) J Biochem Biophys Methods 3:273–284
Jäckle H (1979) Anal Biochem 98:81–84
Görg A, Postel W, Westermeier R, Gianazza E, Righetti PG (1981) Electrophoresis '81. Allen RC, Arnaud P (eds) W de Gruyter, Berlin New York, p 257–270
Görg A, Postel W, Westermeier R (1977) Z Lebensm Unters Forsch 164:160–162
Weber K, Osborn M (1975) The Proteins, Vol 1, Chap 3, Neurath H, Hill RL, (eds) Academic Press, London
Slater GG (1968) Anal Biochem 24:215–217
Margolis J, Kenrick KG (1967) Nature (London) 214:1334–1336
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Görg, A., Postel, W. & Westermeier, R. Ultrathin-layer horizontal high-resolution two-dimensional electrophoresis of legume seed proteins with intermediate protein staining. Z Lebensm Unters Forch 174, 286–289 (1982). https://doi.org/10.1007/BF01042959
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