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Moderne Techniken in der angewandten Zellkultur

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Der Experimentator: Zellkultur

Part of the book series: Experimentator ((EXPERIMENTATOR))

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Zusammenfassung

Von der Entwicklung neuer Techniken profitiert nicht nur die Trendforschung, sondern auch die gute alte Zellkultur. Welche experimentellen Moglichkeiten sich daraus fur den Zellkulturanwender ergeben, soll in diesem Kapitel anhand von Beispielen erlautert werden. Allerdings sei dazu erwahnt, dass die hier als Erstes vorgestellte RNAi-Technik vergleichsweise anspruchsvoll und daher fur den Einsteiger eher ungeeignet ist. Man sollte zumindest die Grundlagen der Zellkulturtechnik sicher beherrschen und auch etwas Erfahrung mitbringen. Selbst fur den Routinier ist diese Methode mit Tuft elarbeit verbunden, fur den Anfanger stellt sie eine echte Herausforderung dar. Erst nach intensiver Auseinandersetzung mit der Methodik und nachfolgenden Optimierungsschritten kann die Technik in die Routine ubernommen werden.

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Notes

  1. 1.

    Paraloge sind Gene, die durch Genduplikation innerhalb eines Genoms entstanden sind. Sie entwickeln neue Funktionen, sogar wenn sie mit dem Ursprungsgen verwandt sind.

  2. 2.

    Orthologe sind Gene in verschiedenen Spezies, die sich von einem gemeinsamen Vorfahren ausgehend entwickelt haben. Normalerweise behalten sie die gleiche Funktion im Verlauf der Entwicklung. Die Identifizierung orthologer Gene ist für die zuverlässige Vorhersage der Genfunktion in neu sequenzierten Genomen von Bedeutung.

  3. 3.

    h-TERT steht für human telomerase reverse transcriptase. Gemeint ist damit die katalytische Untereinheit des Enzyms Telomerase, einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase. Sie besteht aus einer essenziellen RNA-Komponente, der katalytischen Enzymuntereinheit und anderen Telomerase-assoziierten Proteinen. Die natürlichen Enden der Chromosomen, die Telomere, haben ein Endreplikationsproblem, was dazu führt, dass bei jeder Replikationsrunde der Zellen die Telomere DNA-Verluste erleiden und dadurch kürzer werden. Die Telomerase kompensiert die Verluste, indem sie evolutionär konservierte Telomersequenzen (TTAGG)n an die Chromosomenenden anhängt. Zellen können durch die Transfektion mit TERT, dem katalytisch aktiven Teil der Telomerase, immortalisiert werden. Das beruht darauf, dass Zellen, die den ständig aktiven Teil des Enzyms exprimieren, keine Seneszenz zeigen, keinen Zellzyklusarrest machen und auch keine Apoptose einleiten. Sie sind dadurch praktisch unsterblich (immortal) geworden.

  4. 4.

    Ein PCR-Produkt aus genomischer DNA ist durch die Intron-Sequenzen erheblich länger als ein Amplifikat aus cDNA, das mit denselben Primern in der PCR amplifiziert wurde. Ist ein PCR-Fragment mit Intron z. B. 4000 Basenpaare (bp) lang, ist das entsprechende Fragment ohne Intron von reiner cDNA amplifiziert dagegen nur noch 200 bp lang. Will man nun ein PCR-Produkt ausschließlich vom cDNA-Template erhalten, kann man durch folgende Vorgehensweise sicherstellen, dass keine genomische DNA amplifiziert wird: Durch die Wahl einer kurzen Extensionszeit von etwa 20 Sekunden kann aufgrund der Prozessivität der Polymerase, die ca. 1000 bp/min Extensionszeit beträgt, eine Amplifikation des großen Fragments verhindert werden. Die kurze Extensionszeit macht es nahezu unmöglich, dass ein derart großes Fragment amplifiziert wird. Eine weitere Möglichkeit ist, bei der RNA-Isolierung einfach einen DNase-Verdau durchzuführen. Dadurch wird die DNA verdaut, während die RNA übrig bleibt, die dann als reines Template in der RT-PCR eingesetzt wird.

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  1. Sabine Schmitz
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Schmitz, S. (2011). Moderne Techniken in der angewandten Zellkultur. In: Der Experimentator: Zellkultur. Experimentator. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-8274-2573-7_14

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