Zusammenfassung
Wie bereits unter Kap. 13 erwähnt, ist die Quantifizierung der amplifizierten PCR-Produkte nach 25–30 Zyklen nicht mehr sehr einfach. Damit eine Quantifizierung der zu untersuchenden Amplicons (ca. 50–150 bp Länge) ermöglicht werden kann, haben sich verschiedene optische PCR-Systeme zur „online“ Beobachtung des Amplifikationsstatus etabliert (Tab. 14.1).
Diese PCR wird auch als „Real-Time“-PCR bezeichnet, da die Quantität der amplifizierten Matrizen direkt abgelesen werden kann (Freeman et al. 1999). Als Detektionshilfsmittel (Real-Time-Proben) für die Amplifikationsmenge werden i. d. R. fluoreszierende Moleküle (Fluorophore) eingesetzt, die an sequenzspezifische Oligonucleotide endständig gekoppelt sind. Hierbei kommen verschiedene Methoden zum Einsatz (Tab. 14.2), wobei die Wahl der erforderlichen Real-Time-Proben abhängig von der jeweiligen Fragestellung und dem einzusetzenden Real-Time-PCR Instrument ist.
Ein umfassendes Review über die Real-Time PCR wurde von Kubista und Kollegen publiziert (Kubista et al. 2006)
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Notes
- 1.
Diese Temperatur ist sehr stark vom Tm-Wert der eingesetzten Oligonucleotide abhängig! Die einzelnen Tm-Werte der verschiedenen Oligonucleotidpaare sollten bei der gewählten Annealing-Temperatur gleich gut binden.
- 2.
Nach Abschluss der PCR-Zyklen wird i. d. R. RT-Temperatur einprogrammiert, wobei die tatsächliche ca. 3-5 °C über die RT in Abhängigkeit des Gerätes liegen wird.
- 3.
Diese Temperatur ist sehr stark von dem Tm-Wert der eingesetzten Oligonucleotide abhängig! Die einzelnen Tm-Werte der verschiedenen Oligonucleotidpaare sollten bei der gewählten Annealing-Temperatur gleich gut binden.
- 4.
Diese Temperatur ist sehr stark von dem Tm-Wert der eingesetzten Oligonucleotide abhängig! Die einzelnen Tm-Werte der verschiedenen Oligonucleotidpaare sollten bei der gewählten Annealing-Temperatur gleich gut binden.
- 5.
Das Monitoring der Fluoreszenz kann in Abhängigkeit des eingesetzten Real-Time-PCR Instrumentes variieren. Hierfür ist nach Angaben des Herstellers zu verfahren.
- 6.
Diese Temperatur ist sehr stark von dem Tm-Wert der eingesetzten Oligonucleotide abhängig! Die einzelnen Tm-Werte der verschiedenen Oligonucleotidpaare sollten bei der gewählten Annealing-Temperatur gleich gut binden.
Literatur
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Kubista M (2006) The real-time polymerase chain reaction. Mol Apsects Med 27:95
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Müller, HJ., Prange, D.R. (2016). Real-Time-PCR. In: PCR - Polymerase-Kettenreaktion. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-662-48236-0_14
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