RACE-PCR

Zusammenfassung

Die RACE-PCR ist eine Weiterführung der Megaprime-PCR in Kombination mit der RT-PCR, wobei hier die Isolierung eines vollständigen cDNA-Klons im Vordergrund steht. Ausgehend von einer mRNA ist es sehr schwierig komplette mRNA-Sequenzen in DNA umzuschreiben. Gerade bei größeren Fragmenten (> 1000 Basen) ist die Reverse Transkription aufgrund degradierter mRNA oder ineffizienter RTasen nicht immer erfolgreich, sodass keine „Full Length“ cDNA Klone synthetisiert werden. Damit aber die vollständigen Sequenzen erhalten werden, wurde die „Rapid Amplification of cDNA Ends“ (RACE) PCR entwickelt (Frohman et al. 1988). Basis dieser Anwendung ist die Amplifikation des i. d. R. vorhandenen 3′-Endes einer spezifischen mRNA durch ein genspezifisches 3′- und ein flussaufwärts befindliches 5′-Oligonucleotid. Ist die gesamte mRNA-Sequenz bekannt, dann sollte das 5′-Oligonucleotid soweit wie möglich von dem 3′-Oligonucleotid entfernt gewählt werden. Die einzige Beschränkung ist nur durch die vorhandenen Fragmentgrößen der mRNAs gegeben. Spätestens nach der ersten RT-PCR erfährt man, ob die gewünschten Fragmentgrößen vorhanden waren oder nicht. Es sollten mRNA-Längen bis zu 2000 Basen zu erwarten sein, aber dieses ist immer von der RNA-Präparation und der Konzentration aktiver RNasen im Ausgangsmaterial (Gewebe, Zellen) abhängig.