Abstract

BACKGROUND:

The Asian hornet (Vespa velutina nigrithorax), a wasp species, has attacked honey bee populations and affected the beekeeping industry in Korea over the past 15 years. However, little research has been done with this invasive species. In this study, we investigated the intestine bacterial microbiota of Asian hornets and honey bees to design an attractive trap for Asian hornets.

METHODS AND RESULTS:

Genomic DNAs isolated from the intestine microorganisms of Asian hornets and honey bees were utilized to amplify bacterial 16S rDNA for the comparative sequence analysis. The next generation sequencing analysis identified that the orders Flavobacteriales as the most abundant intestinal microorganisms in Asian hornets, showing a clear difference compared to honey bees in which Aeromonadales are dominant. We also report five newly identified 16S rDNA sequences of Asian hornet intestinal bacteria. According to the sequence blast search, these five bacteria belong to the genera Thalassomonas, Caedobacter, Vampirovibrio, Alkaliphilus and Calothrix.

CONCLUSION:

While Asian hornets and honey bees show similar intestine bacterial diversity, the relative ratio of bacterial populations is different. providing useful information to design pest control agents specifically targeting Asian hornets.

Keyword

Asian hornet,Honey bee,Intestine bacterial microbiota

서론

국가간 이동과 물류 이동의 증가는 다양한 방식으로 생태계를 교란하는 결과를 가져온다 (Seebens et al., 2017). 생태계 교란종으로 알려져 있는 생물종들 중 등검은말벌 (Asian hornet, Vespa velutina)은 중국의 윈난 지역이 원산지이며, 비슷한 기후를 가진 유럽 지역으로 차츰 이동해 영국으로까지 퍼져나갔다 (Monceau et al., 2014; Budge et al., 2017). 이들의 강력한 생태계 침입 능력은 이들의 생식 능력 (Darrouzet et al. 2015; Poidatz et al. 2017) 및 비행 능력 (Sauvard et al. 2018) 분석을 통해 증명되었으며, 유사 침입종들의 분포 모델링을 위해 이용되는 침입종 대표 모델이다 (Barbet-Massin et al. 2018).

한국에서 등검은말벌은 꿀벌에 피해를 입히는 최고의 해충으로 부상하고 있다. 2003년에 부산항에서 처음 발견되어 초기 겨울을 지내지 못할 것이란 예상을 벗어나 15년 동안 남한 전체로 퍼져나간 높은 적응력과 번식력을 보여주며 최고의 침입종임을 입증하였다. 등검은말벌의 적응력과 번식력에 도움을 준 외부 요인들은 아열대성으로 변화되어가는 한반도의 기후와 풍족한 먹이 및 천적의 부재이다.

이에 한국에서는 등검은말벌의 피해를 줄이기 위한 다양한 방제법이 연구되고 있으며, 그 중 유인제 개발은 방제법의 중요한 한 축이다. 벌집 추출물 또는 벌 페로몬 등 등검은말벌을 유인할 수 있는 화합물의 연구 및 개발이 활발히 진행되고 있다 (Choi et al., 2015; Kang et al., 2016).

동물에서 장내 미생물의 종류와 양은 숙주의 건강에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(D’Argenio and Salvatore, 2015). 즉, 장내 미생물은 숙주의 식생활을 규정하고 선호하는 음식을 결정짓는 역할을 한다. 등검은말벌은 꿀벌을 먹이로 하는 육식 곤충으로 식생에 있어 꿀벌과 큰 차이를 보인다. 본 연구에서는 등검은말벌과 꿀벌의 장내 박테리아 군집을 비교 분석하여 그 종류와 분포의 차이를 조사하였다. 이를 통해 꿀벌을 배제하고 등검은말벌을 선택적으로 유인할 수 있는 유인제 개발에 이용할 수 있는 방법을 탐색하고자 하였다.

재료및방법

Genomic DNA 추출 및 PCR 반응

말벌과 꿀벌은 광주광역시 인근에서 채집하였다. 70% EtOH에서 벌의 외피를 살균하고 장을 꼬리침과 함께 분리했다. 분리된 장은 30% glycerol 용액 500 μL에 침지하여 -80℃에 냉동 보관하였다. Genomic DNA 추출을 위해 보관용 glycerol을 제거하고 막자로 장 전체를 갈은 시료를 준비하여 변형된 DNA 추출법을 따라 추출하였다 (Kouduka et al., 2012). 100 mM NaOH 용액 첨가하고 95℃에서 15분간 간헐적으로 흔들어주며 정치한 후 Tris-HCl (pH 7.0)을 첨가하여 중화하였다. 10000 rpm 에서 5분간 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고 용액층을 PCR 반응에 사용하였다. 염기서열 분석을 위한 시료는 Illumina 16S Metagenomic sequencing library protocols을 따라 다음과 같이 준비하였다. PCR 반응은 ex-Taq polymerase (Takara, Japan)를 이용해 annealing 온도를 60℃로 설정하여 25 cycle 증폭하였다. 16S rDNA 증폭용 primer로는 16S Amplicon PCR Forward Primer 5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTG TATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGAAG-3’와 16S Amplicon PCR Reverse Primer 5’-GTCTCGTG GGCTCGGAGATGTCTATAAGAGACAGGACTACHV GGGTATCTAATCC-3’를 이용하여 박테리아 16S rDNA의 V3-V4 위치를 증폭하였다 (Petrosino et al., 2009). PCR 결과물은 전기영동으로 확인 후 Qiagen Plasmid Purification kit (Qiagen, Germany)을 이용하여 정제하였으며, 이후 multiplex index들과 Illumina sequencing adapter 추가를 위한 index PCR을 8 cycle 실시하였다. 최종 결과물은 normalization을 거친 후 MiSeqTM platform (Illumina, San Diego, USA)을 이용해 염기서열을 분석하였다 (Macrogen, Korea).

Sequencing 결과 분석

Adaptor 부위를 제외한 후, 꿀벌에서 99,721,194개, 등검은말벌에서 93,614,940개의 염기가 분석되었다. 분석된 염기서열을 나타내는 Sequencing read는 꿀벌에서 439,378개, 등검은말벌에서 417,848개를 얻었고 각각 8715 OTU와 6718 OTU의 bacterial 16S rDNA가 분석되었다 (Table 1).

결과및고찰

분석된 전체 박테리아의 count 수를 Table 2에 정리하였다. Table 2를 바탕으로장내 박테리아들의 점유율을 백분율로 계산하고 백분율 값으로 꿀벌과 등검은말벌 장내 박테리아를 다양한 계통 수준에서 분석했다 (Fig. 1). 꿀벌과 비교해서 등검은말벌 장내에 우점하는 박테리아 목 (order)은 Flavobacteriales와 Sphingobacterales로 분석되었고, 반대로 꿀벌에서 더 우점인 목은 Aeromonadales와 Alteromonadales였다. Flavobacteriales와 Sphingobacterales은 둘 다 Bacteroidetes 문 (Phylum)에 속하는 대표적인 박테리아 그룹으로 동물의 장과 피부에서부터 환경 속 토양에 이르기까지 모든 생태 환경에서 발견되는 박테리아를 포함한다. 꿀벌에서 비교 우점으로 나타나는 박테리아인 Aeromonadales은 대장균, 살모넬라균 등 병원균으로 대표되는 Proteobacteria 문에 속하는 종류로서 등검은말벌에 비해 두 배 이상으로 높게 서식하는 것으로 나타났다. 이러한 차이는 지금까지 보고되지 않은 것으로, 등검은말벌과 꿀벌의 다른 식생활에서 기인한 것인지에 관하여 지속적인 연구가 필요할 것이다.

속 (genus) 수준에서 우점 비율에 차이를 보이는 박테리아를 구체적으로 특정하였다 (Table 3). 등검은말벌은 Sphingobacterales 중 Pedobacter의 비율이 유의하게 증가된 수준을 보이며 그 중에서도 특히 Pedobacter nyackensis 와 Pedobacter oryzae 종 (species)의 비율이 증가하였다. 앞서 목 분류 수준에서 차이를 보이지 않은 Proteobacteria문의 Novosphingobium aromaticivorans은 등검은말벌에 서 증가된 비율을 보였다. 꿀벌에서 증가된 Aeromonadales 목의 경우 발견된 두 가지 종인 Aeromonas hydrophila와 Aeromonas taiwanensis 모두 2배 이상 비율이 증가하였다.

분석된 장내 박테리아에서 4% 이상으로 우점하는 대표 박테리아 종으로 각각 7개씩 선택할 수 있었고, 이들 대표 박테리아 종의 우점 비율을 비교했을 때 등검은말벌의 경우 높은 비율을 차지하는 박테리아 순서로 Aeromonas taiwanensis, Favobacterium anhuiense, Pseudomonas guineae, Pedobacter nyyackensis, Flavobacterium macrobrachii가 각각 5% 이상의 비율을 점유하며 이들과 함께 아직 동정되지 않은 박테리아가 전체의 약 70%를 차지한다. 꿀벌의 경우 Aeromonas taiwanensis, Pseudomonas guineae, Flavobacterium anhuiense, Shewanella xiamenensis 4 종이 5% 이상의 비율로 존재하며 이들 박테리아가 전체의 70% 가까이 점유하는 것으로 분석된다 (Fig. 2). 가장 큰 차이는 꿀벌에서 약 40%의 비율을 차지하는 Aeromonas waiwanensis가 등검은말벌에서 절반의 비율로 줄어든 것이다. 등검은말벌의 장은 꿀벌의 장에 비해 더 많은 우점종을 가지며, 꿀벌은 적은 종류의 박테리아가 우점하는 비율이 높은 생태 환경을 만들고 있다는 결론을 얻을 수 있었다.

마지막으로, 아직 동정되지 않은 새로운 박테리아의 염기서열이 꿀벌에 비해 등검은말벌에서 크게 증가한 비율로 검출되었다. Thalassomonas, Caedobacter, Vampirovibrio, Alkaliphilus 그리고 Calothrix 속에 속하는 박테리아들로 예상되며 이들의 16S rDNA 염기서열과 가장 가까운 염기서열을 가진 종을 Table 4에 표시하였다. 이러한 결과는 등검은말벌 장내 박테리아 군집에 대한 연구의 가치를 의미하는 것으로 사료된다.

Note

The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT

This work was supported by Korea national research foundation NRF-2017R1D1A1B03036241.

Tables & Figures

Table 1.

Community richness and diversity indexes

Table 2.

Bacterial microorganism in Asian hornet and Honey bee

Fig 1.

Graphic comparison of bacterial population ratio of Asian hornet and honey bee in the order level.

Table 3.

Bacterial microbiome comparison between Asian hornet and honey bee in the genus level

Fig 2.

The population ratio of major bacteria species in the Asian hornet and honey bee intestine.

Table 4.

Unidentified bacterial 16S rDNA sequences from Asian hornet intestine

References

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