引用本文： 邢飞, 吴岐佑, 者漫, 罗荣, 项舟, 刘明. 无机生物材料在骨修复中的骨免疫调节作用. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(4): 517-522. doi: 10.7507/1002-1892.202112025 复制
创伤、肿瘤、感染等原因导致的大段骨缺损一直是临床治疗难点，自体骨移植修复是治疗“金标准”，但是存在取骨量有限、供骨区并发症等问题。采用组织工程技术构建的生物支架在骨缺损治疗方面具有广阔应用前景[1]。目前，已有大量研究采用各种物理化学手段结合不同来源种子细胞，成功构建了多种骨修复生物材料[2]，根据来源大致分为无机生物材料、有机生物材料以及复合生物材料三类[3]。其中，无机生物材料主要包括生物陶瓷、生物玻璃等，具备良好骨传导性、生物相容性、骨诱导活性，可以模拟骨矿物相化学成分，直接促进成骨相关细胞表达相关基因、蛋白，已作为基础材料被广泛用于骨修复。
随着对无机生物材料促进骨修复研究的不断深入，越来越多的研究发现免疫系统在骨修复过程中发挥了重要作用。无机生物材料植入生物体骨缺损内部后，作为机体的“外来物质”，最先接触并激活机体免疫系统，被激活的免疫系统会与材料一起参与到后续骨修复过程[4]。随着“骨免疫”概念的提出，越来越多的研究者将免疫与骨修复联系起来，并确定了免疫调节在骨修复过程中具有重要作用[5]。此外，无机生物材料除了可以直接作用于成骨细胞促进骨修复，还可以通过调控免疫系统间接促进骨修复。本文就无机生物材料在骨修复过程中的免疫调节作用作一综述，为进一步构建具备良好免疫调节作用的无机生物材料提供思路。
1 骨组织损伤修复
骨组织是骨骼肌肉组织的主要组成部分，由矿物质、有机基质和水组成[6]，对于支撑身体及运动起着十分重要的作用。骨组织损伤后自我修复功能就会启动[7]。骨愈合是一种复杂、动态的自我修复过程，免疫细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞和软骨细胞作为重要角色均参与到整个修复过程中。
骨修复过程大致可以分为血肿炎症机化期、骨痂形成期和骨痂重塑期[8]。① 血肿炎症机化期是指骨组织受损时，骨组织和周围软组织内的微血管网络破裂，体内凝血系统被激活形成局部血肿，同时伴有炎症细胞大量募集释放，进而引起急性炎症反应[4]。炎症细胞释放IL-1、IL-6、TNF等大量促炎因子，进而募集MSCs，促进局部微血管形成，同时多种骨修复相关细胞侵入，血肿逐渐机化并形成肉芽组织，最终演变成纤维结缔组织[9]。② 骨痂形成期主要包括相关炎症因子刺激成骨相关细胞增殖并分化为骨细胞，表达相关成骨基因，分泌成骨相关蛋白。同时血管继续长入新生骨基质中并形成钙化结节，进而形成骨小梁。骨折损伤部位的骨痂主要通过膜内化骨和软骨内化骨形成。③ 骨痂重塑期，局部血管形成减少，巨噬细胞开始与成骨细胞交替进行骨痂重塑，同时受生物力学影响，应力轴线上的骨痂不断增强，非应力轴线上的多余骨痂不断被清除，新生的板层骨分布与应力轴线方向一致，最终形成具备完整哈弗系统的新生骨组织[10]。骨修复过程的3个时期不是完全按照先后顺序进行，而是交替进行。
2 免疫系统在骨修复中的作用
炎症是机体复杂防御过程，反映了机体对各种有害刺激的反应。机体的免疫器官、免疫细胞和免疫因子组成了免疫系统，其具有识别和排除抗原性异物，与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。骨髓中除了存在大量MSCs外，还有大量T细胞、B细胞、单核细胞以及巨噬细胞等免疫细胞[11]，各种免疫细胞约占骨髓中细胞总数的20%[12]。骨骼肌肉系统与免疫系统还共享众多细胞调节因子。免疫系统不仅参与维持正常骨组织中的骨内稳态，同时在骨损伤后修复中起着重要作用。
巨噬细胞作为免疫系统的重要成员，在发挥免疫调节功能之外，还在骨修复过程中扮演十分重要的角色。在骨折愈合过程中，巨噬细胞可以吞噬细胞碎片以及无序的细胞外基质，并且可以驱动炎症修复的第1阶段[13]。此外，巨噬细胞还可以通过分泌促血管生成因子和促有丝分裂因子，促进骨痂形成和骨痂重塑。目前研究发现巨噬细胞包含具有促炎功能的M1型和抗炎功能的M2型两个亚型，在不同组织环境中两种亚型巨噬细胞可以相互极化，参与并调控骨组织的修复与再生[5]。在骨修复早期，M1型巨噬细胞通过释放VEGF、TNF、FGF等因子诱导血管周围细胞募集和尖端细胞内皮分化，以启动毛细血管芽生成[14]。此外，M1型巨噬细胞可以通过抑制成骨细胞分化和促进成骨细胞凋亡来调控成骨细胞，进而阻碍成骨细胞产生胶原蛋白，促进矿化。M2型巨噬细胞可以通过分泌IL-10、TGF、IL-1和BMP-2等因子抑制破骨细胞活动，同时促进成骨细胞分化和新骨形成[15]。M1、M2型巨噬细胞的平衡对于骨组织代谢动态平衡起着十分重要的作用。免疫系统可以通过M1型和M2型的相互转换实现对不同骨修复阶段的动态调控作用。
3 改变无机生物材料物理特性实现骨修复免疫调控
无机生物材料植入机体后，材料表面与宿主组织直接接触，必然会引起局部组织的免疫炎症反应。研究表明可以通过改变无机生物材料孔隙率及孔径、力学强度、粗糙度和拓扑结构等物理特性，实现骨修复过程中的免疫调控[16]。
3.1 适宜的孔径和孔隙率调控血管生成
通过调整材料孔隙率和孔径可调控成骨细胞行为、巨噬细胞极化和免疫反应[17]。无机生物材料具有适宜的微孔径，可以通过形成内部缺氧微环境，促进巨噬细胞分泌VEGF，进而促进微血管形成[18]。但支架内部孔径过小会增强局部炎症反应，导致肉芽组织的形成，完全堵塞微孔，从而在周围骨细胞和植入物之间形成屏障，阻碍骨修复，最终导致骨组织再生受损和植入失败[19]。研究显示无机生物材料孔径在90～120 μm时，有利于软骨生成同时抑制血管生成；当孔径在350 µm时则可以促进成骨和成血管形成[20]。整体而言，在一定范围内，无机生物材料孔径越大，越有利于抑制炎症反应，进而抑制血管生成[21]。此外，较高的孔隙率可以有效促进成骨细胞黏附、生长，形成丰富的细胞外基质，并加强早期生物固定，但同时会降低无机生物材料支架的力学强度[22]。因此，在维持支架适宜力学强度的同时，选用合适的孔隙率以及孔径可以有效加强支架的免疫调控作用，进而促进骨组织再生。
3.2 表面粗糙度调控巨噬细胞极性转化
无机生物材料的表面粗糙度直接影响免疫细胞的生物活性因子释放，进而调控血管新生和干细胞成骨分化。研究发现材料表面粗糙度可以改变附着于表面的免疫细胞形态，进而调节相关促炎因子和趋化因子的产生[22]。Hotchkiss等[17]通过研究不同表面粗糙程度的材料对巨噬细胞活化的影响，发现增加表面粗糙度可以激活整合素-细胞骨架复合体调控巨噬细胞向M2型极化，同时进一步促进IL-4和IL-10的生成；而降低表面粗糙度可以促进巨噬细胞向M1型极化，进而促进IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。Zhu等[23]成功利用水热法制备了具备高表面粗糙度的双相磷酸钙生物陶瓷。首先将其修复比格犬长骨骨缺损，结果发现表面粗糙的双相磷酸钙生物陶瓷比表面光滑材料具备更好的骨修复能力。然后，将两种材料与MSCs共培养，体外基因微阵列分析结果表明，表面粗糙的双相磷酸钙生物陶瓷能诱导与炎症相关的基因水平急剧下调，抑制TNF信号通路。上述研究结果均提示增加材料表面粗糙度可以有效调控免疫细胞极化，进而促进骨修复。
3.3 表面拓扑结构调控免疫细胞反应
骨组织的微观拓扑结构对于骨修复调控起着十分重要的作用。无机生物材料表面拓扑结构可以仿生模拟骨组织天然纳米物理结构，实现骨免疫调节作用。通过控制生物材料表面拓扑结构，可以调控局部免疫细胞反应，进而产生局部可控的成骨免疫微环境来调节骨动力学[24]。生物材料的表面拓扑结构排列（无序程度）、尺寸可以对成骨分化产生显著影响，还可调节免疫细胞延伸、黏附、排列、迁移和分化。越来越多的研究者将选择具备特定表面拓扑结构的生物材料作为实现骨免疫调节的重要工具之一。随着生物材料加工技术的不断发展，研究者通过在生物材料表面构建纳米坑、纳米柱、纳米凹槽、纳米管等拓扑结构来调控骨免疫过程，实现骨组织再生[25]。Yang等[26]联合光热法和水热法在羟基磷灰石生物陶瓷表面制备了3种微米级圆形图案（4、12、36 μm）和纳米形貌（纳米针、纳米片和纳米棒），用于研究不同拓扑结构对巨噬细胞的反应。体外研究发现不同的拓扑结构可以减轻或促进巨噬细胞极化，进而影响MSCs成骨分化和脐静脉内皮细胞的血管生成活性。Neacsu 等[27]研究了纳米管在不同条件下对巨噬细胞的体外细胞学行为，发现纳米管结构可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路来减少炎症介质的释放，减弱巨噬细胞的炎症反应。不同的表面拓扑结构可以影响不同骨免疫环境，以改善后续成骨活动。因此，在材料表面构建特定的表面拓扑结构，可以为骨修复构建适宜的骨免疫微环境，进而加快骨修复进程。
3.4 力学强度和晶体颗粒大小调控巨噬细胞极性转化
材料的力学强度或晶体颗粒大小可以影响并调控各类免疫细胞的生物学反应[13]。在低硬度材料表面，骨髓来源巨噬细胞表面标记物CD86的表达上调，细胞内活性氧增加，同时分泌更多的IL-1β和TNF-α，促进巨噬细胞向M1型极化。在高硬度材料表面，骨髓来源巨噬细胞的CD206表达上调更多，活性氧减少，并分泌更多的IL-4和TGF-β，促进巨噬细胞向M2型极化[28]。
除了自身力学性能之外，无机生物材料可以通过调整晶体颗粒大小改变材料自身比表面积，进而影响巨噬细胞的黏附和极化，调控成骨活动以及成血管分化。早期研究发现当磷酸钙生物陶瓷晶体颗粒粒径在1 μm左右时，可以明显促进异位骨化[29]。Davison等[30]采用比格犬肌肉包埋模型研究磷酸钙生物陶瓷晶体颗粒大小对免疫细胞的影响，发现与粒径2～4 μm晶体颗粒相比，粒径为1 μm的晶体颗粒有更多的多核破骨细胞样细胞聚集。此外，黏附在晶体颗粒粒径为2～4 μm的生物陶瓷表面的RAW264.7细胞在核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）诱导下，其增殖和分化为多核破骨细胞样细胞的能力均受到显著抑制。Li等[31]对比了两种微米级和亚微米级磷酸钙生物陶瓷骨免疫调节功能差异。体外研究发现，亚微米级生物材料可以通过激活PI3K/AKT 信号通路调节巨噬细胞向M2型极化，进而促进MSCs成骨分化；体内研究发现，亚微米级生物材料植入体内之后可以募集更多巨噬细胞，并诱导这些巨噬细胞向M2型极化。
4 改变无机生物材料化学特性实现骨修复免疫调控
对无机生物材料表面进行化学修饰，旨在通过与蛋白质等可溶性分子的相互作用，影响免疫细胞的细胞学行为。无机生物材料的化学特性主要包括表面润湿性、表面电荷、官能团和材料成分。近年来，越来越多的研究通过改变无机生物材料表面的化学特性，提高支架材料自身骨免疫调控特性，进而促进骨修复。
4.1 表面润湿性调控免疫因子释放
生物材料的表面润湿性与蛋白质吸附、血凝块形成和纤维蛋白形成密切相关[32]。具备不同表面润湿性的生物材料可以吸附不同类型及数量的蛋白质，高度亲水性生物材料通常具有蛋白质抗性，而疏水性生物材料的疏水部分则具备内在的免疫原性[33]。Vishwakarma等[34]评估了生物材料表面润湿性对材料表面血清衍生蛋白层形成的作用以及对诱导免疫反应的影响，发现亲水性羧基表面有利于白蛋白吸附，而疏水性烃表面有利于IgG2吸附。Kakizawa等[35]利用聚氨基酸包覆的二氧化硅纳米颗粒研究生物材料物理粒子特性和刺激条件对免疫细胞中细胞因子产生的影响，结果显示IL-1β和IFN-γ的分泌与聚氨基酸的疏水性程度相关，疏水颗粒可以上调T细胞中IFN-γ表达水平。但也有研究发现提高生物材料表面亲水性会降低巨噬细胞的黏附能力，进而抑制TNF-α、MCP-1和IL-1β等多种促炎因子的分泌[36]。因此，有关无机生物材料表面润湿性对免疫细胞的调节作用，仍需更多研究来确定。
4.2 表面电荷和官能团调控骨免疫过程
无机生物材料表面电荷对免疫细胞具有调控功能。表面的正电粒子可增强免疫细胞相关炎症通路的激活，负电粒子可调控巨噬细胞的迁移行为，同时抑制相关炎症反应，促进调节性T细胞表达。Bartneck等[37]研究了表面电荷修饰对巨噬细胞炎症特征的影响，发现表面正电荷的氨基修饰可以诱导巨噬细胞向M2型极化，表面负电荷的羧基修饰可以诱导巨噬细胞向M1型极化。此外，Neumann等[38]研究了微粒表面电荷对于NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎症小体的作用，发现与带负电荷的粒子相比，带正电荷的粒子可以促进炎症小体的激活。
此外，生物骨修复材料的表面官能团可以通过影响表面电荷，调节骨免疫过程。生物材料表面的氨基和羟基可以有效提高免疫细胞的浸润能力，并在体内诱导生物材料周围形成较厚的纤维包膜[39]。Barbosa等[40]研究了不同表面官能团的急性炎症反应。结果发现，与表面带有其他官能团的生物材料相比，表面带有羟基和羧基的生物材料在植入体内后可以局部诱导更多的炎症细胞浸润。Kamath等[39]使用小鼠皮下植入模型评估不同表面官能团对宿主组织反应的影响，发现含有羟基和氨基的生物材料表面出现更厚的纤维囊并伴随大量炎症细胞浸润，而含有氟甲基和羧基的生物材料表面则表现出较低的炎症/纤维化反应与炎症细胞浸润。此外，羟基、氨基和羧基还可不同程度地增强离子、巨噬细胞极化和细胞局部黏附。Keselowsky等[41]用固定密度的单一黏附配体纤维连接蛋白模型系统研究羟基、羧基、氨基对黏着斑组装和信号传导的影响，发现羟基能向黏附结构最高程度地募集踝蛋白、α 肌动蛋白、桩蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白。
4.3 构建复合材料实现骨修复免疫调控
随着骨免疫相关研究的不断深入，越来越多的研究将无机生物材料与其他成分混合构建复合材料用于骨免疫调控。相比于单一的无机生物材料，复合材料具备更好的生物学特性，应用范围也更广。镁金属因具有生物降解、生物相容性和骨传导特性，被认为是骨科与整形外科的革命性金属。但高降解率会导致过度炎症反应，限制了其在骨组织工程中的应用。Chen等[14]使用化学浸没法将β-磷酸三钙涂覆在镁金属支架表面，用于提高支架的骨免疫调节特性。体内研究结果发现该支架可以通过抑制Toll 样受体信号通路调控巨噬细胞向M2型极化，同时抑制破骨细胞增殖，降低巨噬细胞集落刺激因子和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的表达。Hung等[42]构建了硅酸钙陶瓷，研究其是否具有抗破骨细胞生成作用。结果发现在硅浓度>4 mmol/L时，硅以剂量依赖性方式降低RANKL水平，增强TRAP活性，同时硅还可降低RANKL升高的组织蛋白酶K表达，抑制TRAF6介导的NK-κB信号通路激活，进而抑制破骨细胞生成。Chen等[43]比较了双相磷酸钙生物陶瓷、磷酸三钙、羟基磷灰石的骨免疫调节作用。体外研究发现与其他两种材料相比，双相磷酸钙生物陶瓷可以有效提高CD206阳性表达的M2型巨噬细胞比例，上调M2型标记物的表达；体内研究也发现双相磷酸钙生物陶瓷可以有效调节局部炎症反应，促进局部形成适宜骨修复的免疫微环境。在另一项研究中，Shiwaku等[44]比较了不同含量羟基磷灰石的双相磷酸钙生物陶瓷对破骨细胞分化的影响。研究结果发现破骨细胞的活性会因羟基磷灰石含量增加而部分受损，但不会因双相磷酸钙生物陶瓷支架内微孔的存在而受损。此外，羟基磷灰石含量低的双相磷酸钙生物陶瓷有利于鞘氨醇激酶1等正耦合因子的表达。Li等[45]3D打印IFN-γ/硅酸钙/β-磷酸三钙复合支架，实现了巨噬细胞的顺序极化。早期（1～3 d）释放IFN-γ刺激巨噬细胞向M1型极化，然后释放硅诱导巨噬细胞向M2型极化，并促进血管生成，为加速组织工程支架的血管化和成骨提供了新策略。除此之外，无机生物骨修复材料还可以与脱细胞外基质、质粒DNA、小干扰RNA和微小RNA构建复合体系，用于骨免疫调控[46]。
5 结论
骨组织形成、发育、损伤修复以及骨骼重塑等各个阶段都受到一系列生物化学信号以及物理信号的精确调控，目前很难在体外模拟整个骨修复过程。近年来，研究者发现免疫细胞在骨组织的动态平衡中扮演着十分重要的角色。随着相关研究的不断深入，巨噬细胞作为一类重要的骨免疫细胞引起越来越多研究者的重视。巨噬细胞可以通过释放相关因子，激活相关信号通路，促进成骨和成血管，进而实现对不同阶段骨修复的调控。因此，将免疫细胞作为骨修复过程中的首要目的细胞，利用生物材料驱动免疫细胞构建局部适宜的骨免疫微环境，可能成为组织工程骨修复领域中一个新理论。
近年来，无机生物材料作为一种最常用于骨修复的材料，其骨免疫调节特性受到了越来越多关注。通过改变无机生物材料表面粗糙度、表面润湿性等理化特性，可以直接调控机体内的免疫细胞，构建适宜的免疫微环境，进而实现动态调控成骨过程。此外，无机生物材料通过与其他成分混合构建复合材料，可以克服其自身固有局限，有效提高其骨免疫调节能力，实现对骨微环境有序可控的免疫调节。
虽然免疫细胞在骨修复过程中扮演着重要角色，但是利用免疫系统实现对骨修复过程的精准把控依然是该领域的难题。如何利用生物材料自身理化特性调控巨噬细胞极化，维持免疫与骨修复的微妙平衡，仍然需要组织工程研究者不断探索。充分利用免疫与骨修复的众多共同分子信号靶点实现精准调控可能是一个突破点。此外，目前关于骨免疫调节的相关研究仍集中于巨噬细胞和生物材料相互作用的体内外现象观察。如何进一步完善无机生物材料、免疫系统、骨骼肌肉系统三者的内在复杂信号通路以及潜在的分子靶点，仍需不断研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点及其报道
作者贡献声明 邢飞、吴岐佑：撰写文章；者漫、罗荣：参与文献收集、整理；项舟：指导综述构思、观点形成及文章撰写；刘明：文章审阅、修改
创伤、肿瘤、感染等原因导致的大段骨缺损一直是临床治疗难点，自体骨移植修复是治疗“金标准”，但是存在取骨量有限、供骨区并发症等问题。采用组织工程技术构建的生物支架在骨缺损治疗方面具有广阔应用前景[1]。目前，已有大量研究采用各种物理化学手段结合不同来源种子细胞，成功构建了多种骨修复生物材料[2]，根据来源大致分为无机生物材料、有机生物材料以及复合生物材料三类[3]。其中，无机生物材料主要包括生物陶瓷、生物玻璃等，具备良好骨传导性、生物相容性、骨诱导活性，可以模拟骨矿物相化学成分，直接促进成骨相关细胞表达相关基因、蛋白，已作为基础材料被广泛用于骨修复。
随着对无机生物材料促进骨修复研究的不断深入，越来越多的研究发现免疫系统在骨修复过程中发挥了重要作用。无机生物材料植入生物体骨缺损内部后，作为机体的“外来物质”，最先接触并激活机体免疫系统，被激活的免疫系统会与材料一起参与到后续骨修复过程[4]。随着“骨免疫”概念的提出，越来越多的研究者将免疫与骨修复联系起来，并确定了免疫调节在骨修复过程中具有重要作用[5]。此外，无机生物材料除了可以直接作用于成骨细胞促进骨修复，还可以通过调控免疫系统间接促进骨修复。本文就无机生物材料在骨修复过程中的免疫调节作用作一综述，为进一步构建具备良好免疫调节作用的无机生物材料提供思路。
1 骨组织损伤修复
骨组织是骨骼肌肉组织的主要组成部分，由矿物质、有机基质和水组成[6]，对于支撑身体及运动起着十分重要的作用。骨组织损伤后自我修复功能就会启动[7]。骨愈合是一种复杂、动态的自我修复过程，免疫细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞和软骨细胞作为重要角色均参与到整个修复过程中。
骨修复过程大致可以分为血肿炎症机化期、骨痂形成期和骨痂重塑期[8]。① 血肿炎症机化期是指骨组织受损时，骨组织和周围软组织内的微血管网络破裂，体内凝血系统被激活形成局部血肿，同时伴有炎症细胞大量募集释放，进而引起急性炎症反应[4]。炎症细胞释放IL-1、IL-6、TNF等大量促炎因子，进而募集MSCs，促进局部微血管形成，同时多种骨修复相关细胞侵入，血肿逐渐机化并形成肉芽组织，最终演变成纤维结缔组织[9]。② 骨痂形成期主要包括相关炎症因子刺激成骨相关细胞增殖并分化为骨细胞，表达相关成骨基因，分泌成骨相关蛋白。同时血管继续长入新生骨基质中并形成钙化结节，进而形成骨小梁。骨折损伤部位的骨痂主要通过膜内化骨和软骨内化骨形成。③ 骨痂重塑期，局部血管形成减少，巨噬细胞开始与成骨细胞交替进行骨痂重塑，同时受生物力学影响，应力轴线上的骨痂不断增强，非应力轴线上的多余骨痂不断被清除，新生的板层骨分布与应力轴线方向一致，最终形成具备完整哈弗系统的新生骨组织[10]。骨修复过程的3个时期不是完全按照先后顺序进行，而是交替进行。
2 免疫系统在骨修复中的作用
炎症是机体复杂防御过程，反映了机体对各种有害刺激的反应。机体的免疫器官、免疫细胞和免疫因子组成了免疫系统，其具有识别和排除抗原性异物，与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。骨髓中除了存在大量MSCs外，还有大量T细胞、B细胞、单核细胞以及巨噬细胞等免疫细胞[11]，各种免疫细胞约占骨髓中细胞总数的20%[12]。骨骼肌肉系统与免疫系统还共享众多细胞调节因子。免疫系统不仅参与维持正常骨组织中的骨内稳态，同时在骨损伤后修复中起着重要作用。
巨噬细胞作为免疫系统的重要成员，在发挥免疫调节功能之外，还在骨修复过程中扮演十分重要的角色。在骨折愈合过程中，巨噬细胞可以吞噬细胞碎片以及无序的细胞外基质，并且可以驱动炎症修复的第1阶段[13]。此外，巨噬细胞还可以通过分泌促血管生成因子和促有丝分裂因子，促进骨痂形成和骨痂重塑。目前研究发现巨噬细胞包含具有促炎功能的M1型和抗炎功能的M2型两个亚型，在不同组织环境中两种亚型巨噬细胞可以相互极化，参与并调控骨组织的修复与再生[5]。在骨修复早期，M1型巨噬细胞通过释放VEGF、TNF、FGF等因子诱导血管周围细胞募集和尖端细胞内皮分化，以启动毛细血管芽生成[14]。此外，M1型巨噬细胞可以通过抑制成骨细胞分化和促进成骨细胞凋亡来调控成骨细胞，进而阻碍成骨细胞产生胶原蛋白，促进矿化。M2型巨噬细胞可以通过分泌IL-10、TGF、IL-1和BMP-2等因子抑制破骨细胞活动，同时促进成骨细胞分化和新骨形成[15]。M1、M2型巨噬细胞的平衡对于骨组织代谢动态平衡起着十分重要的作用。免疫系统可以通过M1型和M2型的相互转换实现对不同骨修复阶段的动态调控作用。
3 改变无机生物材料物理特性实现骨修复免疫调控
无机生物材料植入机体后，材料表面与宿主组织直接接触，必然会引起局部组织的免疫炎症反应。研究表明可以通过改变无机生物材料孔隙率及孔径、力学强度、粗糙度和拓扑结构等物理特性，实现骨修复过程中的免疫调控[16]。
3.1 适宜的孔径和孔隙率调控血管生成
通过调整材料孔隙率和孔径可调控成骨细胞行为、巨噬细胞极化和免疫反应[17]。无机生物材料具有适宜的微孔径，可以通过形成内部缺氧微环境，促进巨噬细胞分泌VEGF，进而促进微血管形成[18]。但支架内部孔径过小会增强局部炎症反应，导致肉芽组织的形成，完全堵塞微孔，从而在周围骨细胞和植入物之间形成屏障，阻碍骨修复，最终导致骨组织再生受损和植入失败[19]。研究显示无机生物材料孔径在90～120 μm时，有利于软骨生成同时抑制血管生成；当孔径在350 µm时则可以促进成骨和成血管形成[20]。整体而言，在一定范围内，无机生物材料孔径越大，越有利于抑制炎症反应，进而抑制血管生成[21]。此外，较高的孔隙率可以有效促进成骨细胞黏附、生长，形成丰富的细胞外基质，并加强早期生物固定，但同时会降低无机生物材料支架的力学强度[22]。因此，在维持支架适宜力学强度的同时，选用合适的孔隙率以及孔径可以有效加强支架的免疫调控作用，进而促进骨组织再生。
3.2 表面粗糙度调控巨噬细胞极性转化
无机生物材料的表面粗糙度直接影响免疫细胞的生物活性因子释放，进而调控血管新生和干细胞成骨分化。研究发现材料表面粗糙度可以改变附着于表面的免疫细胞形态，进而调节相关促炎因子和趋化因子的产生[22]。Hotchkiss等[17]通过研究不同表面粗糙程度的材料对巨噬细胞活化的影响，发现增加表面粗糙度可以激活整合素-细胞骨架复合体调控巨噬细胞向M2型极化，同时进一步促进IL-4和IL-10的生成；而降低表面粗糙度可以促进巨噬细胞向M1型极化，进而促进IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。Zhu等[23]成功利用水热法制备了具备高表面粗糙度的双相磷酸钙生物陶瓷。首先将其修复比格犬长骨骨缺损，结果发现表面粗糙的双相磷酸钙生物陶瓷比表面光滑材料具备更好的骨修复能力。然后，将两种材料与MSCs共培养，体外基因微阵列分析结果表明，表面粗糙的双相磷酸钙生物陶瓷能诱导与炎症相关的基因水平急剧下调，抑制TNF信号通路。上述研究结果均提示增加材料表面粗糙度可以有效调控免疫细胞极化，进而促进骨修复。
3.3 表面拓扑结构调控免疫细胞反应
骨组织的微观拓扑结构对于骨修复调控起着十分重要的作用。无机生物材料表面拓扑结构可以仿生模拟骨组织天然纳米物理结构，实现骨免疫调节作用。通过控制生物材料表面拓扑结构，可以调控局部免疫细胞反应，进而产生局部可控的成骨免疫微环境来调节骨动力学[24]。生物材料的表面拓扑结构排列（无序程度）、尺寸可以对成骨分化产生显著影响，还可调节免疫细胞延伸、黏附、排列、迁移和分化。越来越多的研究者将选择具备特定表面拓扑结构的生物材料作为实现骨免疫调节的重要工具之一。随着生物材料加工技术的不断发展，研究者通过在生物材料表面构建纳米坑、纳米柱、纳米凹槽、纳米管等拓扑结构来调控骨免疫过程，实现骨组织再生[25]。Yang等[26]联合光热法和水热法在羟基磷灰石生物陶瓷表面制备了3种微米级圆形图案（4、12、36 μm）和纳米形貌（纳米针、纳米片和纳米棒），用于研究不同拓扑结构对巨噬细胞的反应。体外研究发现不同的拓扑结构可以减轻或促进巨噬细胞极化，进而影响MSCs成骨分化和脐静脉内皮细胞的血管生成活性。Neacsu 等[27]研究了纳米管在不同条件下对巨噬细胞的体外细胞学行为，发现纳米管结构可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路来减少炎症介质的释放，减弱巨噬细胞的炎症反应。不同的表面拓扑结构可以影响不同骨免疫环境，以改善后续成骨活动。因此，在材料表面构建特定的表面拓扑结构，可以为骨修复构建适宜的骨免疫微环境，进而加快骨修复进程。
3.4 力学强度和晶体颗粒大小调控巨噬细胞极性转化
材料的力学强度或晶体颗粒大小可以影响并调控各类免疫细胞的生物学反应[13]。在低硬度材料表面，骨髓来源巨噬细胞表面标记物CD86的表达上调，细胞内活性氧增加，同时分泌更多的IL-1β和TNF-α，促进巨噬细胞向M1型极化。在高硬度材料表面，骨髓来源巨噬细胞的CD206表达上调更多，活性氧减少，并分泌更多的IL-4和TGF-β，促进巨噬细胞向M2型极化[28]。
除了自身力学性能之外，无机生物材料可以通过调整晶体颗粒大小改变材料自身比表面积，进而影响巨噬细胞的黏附和极化，调控成骨活动以及成血管分化。早期研究发现当磷酸钙生物陶瓷晶体颗粒粒径在1 μm左右时，可以明显促进异位骨化[29]。Davison等[30]采用比格犬肌肉包埋模型研究磷酸钙生物陶瓷晶体颗粒大小对免疫细胞的影响，发现与粒径2～4 μm晶体颗粒相比，粒径为1 μm的晶体颗粒有更多的多核破骨细胞样细胞聚集。此外，黏附在晶体颗粒粒径为2～4 μm的生物陶瓷表面的RAW264.7细胞在核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）诱导下，其增殖和分化为多核破骨细胞样细胞的能力均受到显著抑制。Li等[31]对比了两种微米级和亚微米级磷酸钙生物陶瓷骨免疫调节功能差异。体外研究发现，亚微米级生物材料可以通过激活PI3K/AKT 信号通路调节巨噬细胞向M2型极化，进而促进MSCs成骨分化；体内研究发现，亚微米级生物材料植入体内之后可以募集更多巨噬细胞，并诱导这些巨噬细胞向M2型极化。
4 改变无机生物材料化学特性实现骨修复免疫调控
对无机生物材料表面进行化学修饰，旨在通过与蛋白质等可溶性分子的相互作用，影响免疫细胞的细胞学行为。无机生物材料的化学特性主要包括表面润湿性、表面电荷、官能团和材料成分。近年来，越来越多的研究通过改变无机生物材料表面的化学特性，提高支架材料自身骨免疫调控特性，进而促进骨修复。
4.1 表面润湿性调控免疫因子释放
生物材料的表面润湿性与蛋白质吸附、血凝块形成和纤维蛋白形成密切相关[32]。具备不同表面润湿性的生物材料可以吸附不同类型及数量的蛋白质，高度亲水性生物材料通常具有蛋白质抗性，而疏水性生物材料的疏水部分则具备内在的免疫原性[33]。Vishwakarma等[34]评估了生物材料表面润湿性对材料表面血清衍生蛋白层形成的作用以及对诱导免疫反应的影响，发现亲水性羧基表面有利于白蛋白吸附，而疏水性烃表面有利于IgG2吸附。Kakizawa等[35]利用聚氨基酸包覆的二氧化硅纳米颗粒研究生物材料物理粒子特性和刺激条件对免疫细胞中细胞因子产生的影响，结果显示IL-1β和IFN-γ的分泌与聚氨基酸的疏水性程度相关，疏水颗粒可以上调T细胞中IFN-γ表达水平。但也有研究发现提高生物材料表面亲水性会降低巨噬细胞的黏附能力，进而抑制TNF-α、MCP-1和IL-1β等多种促炎因子的分泌[36]。因此，有关无机生物材料表面润湿性对免疫细胞的调节作用，仍需更多研究来确定。
4.2 表面电荷和官能团调控骨免疫过程
无机生物材料表面电荷对免疫细胞具有调控功能。表面的正电粒子可增强免疫细胞相关炎症通路的激活，负电粒子可调控巨噬细胞的迁移行为，同时抑制相关炎症反应，促进调节性T细胞表达。Bartneck等[37]研究了表面电荷修饰对巨噬细胞炎症特征的影响，发现表面正电荷的氨基修饰可以诱导巨噬细胞向M2型极化，表面负电荷的羧基修饰可以诱导巨噬细胞向M1型极化。此外，Neumann等[38]研究了微粒表面电荷对于NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎症小体的作用，发现与带负电荷的粒子相比，带正电荷的粒子可以促进炎症小体的激活。
此外，生物骨修复材料的表面官能团可以通过影响表面电荷，调节骨免疫过程。生物材料表面的氨基和羟基可以有效提高免疫细胞的浸润能力，并在体内诱导生物材料周围形成较厚的纤维包膜[39]。Barbosa等[40]研究了不同表面官能团的急性炎症反应。结果发现，与表面带有其他官能团的生物材料相比，表面带有羟基和羧基的生物材料在植入体内后可以局部诱导更多的炎症细胞浸润。Kamath等[39]使用小鼠皮下植入模型评估不同表面官能团对宿主组织反应的影响，发现含有羟基和氨基的生物材料表面出现更厚的纤维囊并伴随大量炎症细胞浸润，而含有氟甲基和羧基的生物材料表面则表现出较低的炎症/纤维化反应与炎症细胞浸润。此外，羟基、氨基和羧基还可不同程度地增强离子、巨噬细胞极化和细胞局部黏附。Keselowsky等[41]用固定密度的单一黏附配体纤维连接蛋白模型系统研究羟基、羧基、氨基对黏着斑组装和信号传导的影响，发现羟基能向黏附结构最高程度地募集踝蛋白、α 肌动蛋白、桩蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白。
4.3 构建复合材料实现骨修复免疫调控
随着骨免疫相关研究的不断深入，越来越多的研究将无机生物材料与其他成分混合构建复合材料用于骨免疫调控。相比于单一的无机生物材料，复合材料具备更好的生物学特性，应用范围也更广。镁金属因具有生物降解、生物相容性和骨传导特性，被认为是骨科与整形外科的革命性金属。但高降解率会导致过度炎症反应，限制了其在骨组织工程中的应用。Chen等[14]使用化学浸没法将β-磷酸三钙涂覆在镁金属支架表面，用于提高支架的骨免疫调节特性。体内研究结果发现该支架可以通过抑制Toll 样受体信号通路调控巨噬细胞向M2型极化，同时抑制破骨细胞增殖，降低巨噬细胞集落刺激因子和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的表达。Hung等[42]构建了硅酸钙陶瓷，研究其是否具有抗破骨细胞生成作用。结果发现在硅浓度>4 mmol/L时，硅以剂量依赖性方式降低RANKL水平，增强TRAP活性，同时硅还可降低RANKL升高的组织蛋白酶K表达，抑制TRAF6介导的NK-κB信号通路激活，进而抑制破骨细胞生成。Chen等[43]比较了双相磷酸钙生物陶瓷、磷酸三钙、羟基磷灰石的骨免疫调节作用。体外研究发现与其他两种材料相比，双相磷酸钙生物陶瓷可以有效提高CD206阳性表达的M2型巨噬细胞比例，上调M2型标记物的表达；体内研究也发现双相磷酸钙生物陶瓷可以有效调节局部炎症反应，促进局部形成适宜骨修复的免疫微环境。在另一项研究中，Shiwaku等[44]比较了不同含量羟基磷灰石的双相磷酸钙生物陶瓷对破骨细胞分化的影响。研究结果发现破骨细胞的活性会因羟基磷灰石含量增加而部分受损，但不会因双相磷酸钙生物陶瓷支架内微孔的存在而受损。此外，羟基磷灰石含量低的双相磷酸钙生物陶瓷有利于鞘氨醇激酶1等正耦合因子的表达。Li等[45]3D打印IFN-γ/硅酸钙/β-磷酸三钙复合支架，实现了巨噬细胞的顺序极化。早期（1～3 d）释放IFN-γ刺激巨噬细胞向M1型极化，然后释放硅诱导巨噬细胞向M2型极化，并促进血管生成，为加速组织工程支架的血管化和成骨提供了新策略。除此之外，无机生物骨修复材料还可以与脱细胞外基质、质粒DNA、小干扰RNA和微小RNA构建复合体系，用于骨免疫调控[46]。
5 结论
骨组织形成、发育、损伤修复以及骨骼重塑等各个阶段都受到一系列生物化学信号以及物理信号的精确调控，目前很难在体外模拟整个骨修复过程。近年来，研究者发现免疫细胞在骨组织的动态平衡中扮演着十分重要的角色。随着相关研究的不断深入，巨噬细胞作为一类重要的骨免疫细胞引起越来越多研究者的重视。巨噬细胞可以通过释放相关因子，激活相关信号通路，促进成骨和成血管，进而实现对不同阶段骨修复的调控。因此，将免疫细胞作为骨修复过程中的首要目的细胞，利用生物材料驱动免疫细胞构建局部适宜的骨免疫微环境，可能成为组织工程骨修复领域中一个新理论。
近年来，无机生物材料作为一种最常用于骨修复的材料，其骨免疫调节特性受到了越来越多关注。通过改变无机生物材料表面粗糙度、表面润湿性等理化特性，可以直接调控机体内的免疫细胞，构建适宜的免疫微环境，进而实现动态调控成骨过程。此外，无机生物材料通过与其他成分混合构建复合材料，可以克服其自身固有局限，有效提高其骨免疫调节能力，实现对骨微环境有序可控的免疫调节。
虽然免疫细胞在骨修复过程中扮演着重要角色，但是利用免疫系统实现对骨修复过程的精准把控依然是该领域的难题。如何利用生物材料自身理化特性调控巨噬细胞极化，维持免疫与骨修复的微妙平衡，仍然需要组织工程研究者不断探索。充分利用免疫与骨修复的众多共同分子信号靶点实现精准调控可能是一个突破点。此外，目前关于骨免疫调节的相关研究仍集中于巨噬细胞和生物材料相互作用的体内外现象观察。如何进一步完善无机生物材料、免疫系统、骨骼肌肉系统三者的内在复杂信号通路以及潜在的分子靶点，仍需不断研究。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点及其报道
作者贡献声明 邢飞、吴岐佑：撰写文章；者漫、罗荣：参与文献收集、整理；项舟：指导综述构思、观点形成及文章撰写；刘明：文章审阅、修改