引用本文： 许子星, 许卫红, 陈薛敏, 周亦楠. 急性脊髓损伤大鼠血管重构与炎症反应的相关性研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(11): 1429-1437. doi: 10.7507/1002-1892.202003186 复制
急性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后，微血管破裂、神经元损害、脱髓鞘改变会引发一系列病理过程，包括炎症细胞浸润、炎症介质释放和胶质瘢痕形成等，从而抑制组织再生和功能恢复[1-2]。微血管网破坏和炎症反应是 SCI 病理过程中至关重要的两个环节。一项基于自身免疫性脊髓炎动物模型的研究发现，新生血管环绕炎症反应区域，随后邻近血管的皮质脊髓束纤维萌生[3]。这一现象提示微血管网破坏及炎症反应两种病理状态相互关联，是 SCI 后干预治疗的重要靶点。研究证实，微血管在 SCI 后 3 d 内即出现于损伤区域，其密度峰值可达正常的 5 倍以上[4]。普遍认为，内皮细胞可作为吞噬细胞吞噬大颗粒、髓鞘碎片和凋亡细胞等，有助于清除蓄积物而减轻炎症反应。换句话说，一方面微循环障碍是炎症性损害加剧的诱因；另一方面，过度的炎症性损害是阻碍微循环重建的不利因素，二者互为因果，恶性循环终致神经修复障碍和功能丧失[3, 5]。
研究表明，促进微血管网重建，既有望抑制炎症反应，又有利于神经修复[6]。因此揭示微血管重构的动态过程与炎症反应之间的关系，有助于理解 SCI 后极其复杂的病理过程，对 SCI 精准治疗具有重要意义。我们前期研究证实，以改善血管重构为目的的治疗能够减少炎症细胞浸润，促进轴突再生及功能恢复[7]。然而，SCI 发生后，微血管网破坏及重建的动态过程，及其与炎症反应、炎症因子表达的关系尚无深入研究报道。以此为切入点，本研究拟探索不同程度 SCI 后损伤区域微血管密度变化趋势，及其与炎症指标相关关系，研究微血管重构、炎症反应与脊髓组织结构变化转归的关系，旨在为 SCI 研究提供一个血管-炎症模型，为动物造模和靶点治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雌性 SD 大鼠 116 只，体质量 230～250 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠抗大鼠内皮细胞抗原 1（rat endothelial cell antigen 1，RECA1）抗体、兔抗 CD68 抗体、小鼠抗神经微丝（neurofilament-H，NF-H）抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（Abcam 公司，美国）；Alexa568/Alexa488 山羊抗小鼠（或兔）荧光二抗（Invitrogen 公司，美国）；TNF-α、IL-1β、IL-6 的 ELISA 试剂盒（Cusabio 公司，美国）；甲苯胺蓝染液（武汉赛维尔生物技术有限公司）。
MASCIS Impactor-Ⅲ 脊髓撞击器（纽约大学 W.M.Keck 神经科学研究中心，美国）。全自动酶联免疫吸附分析仪（BioTek 公司，美国）；正置荧光显微镜及 DS-U3 成像系统（Nikon 公司，日本）；切片扫描及 Caseviewer2.0 成像系统（Pannoramic 250；3D HISTECH 公司，匈牙利）；Fiji image J 软件（美国国立卫生研究院）。
1.2 实验分组及方法
将 116 只大鼠随机分为 4 组，每组 29 只。假手术组仅切除椎板暴露脊髓，不进行撞击；轻度损伤组以 12.5 mm 高度撞击脊髓；中度损伤组以 25.0 mm 高度撞击脊髓；重度损伤组以 50.0 mm 高度撞击脊髓[8-9]。
各组大鼠采用腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉后，背部常规消毒、铺巾。以 T9～11 棘突为中心，纵向切开长约 3 cm 皮肤，分离背部肌肉，暴露 T9～11 椎板及棘突。用显微咬骨钳咬除 T9～11 椎体棘突，咬除 T10 全椎板，充分暴露脊髓。假手术组直接缝合切口，轻、中、重度损伤组采用 MASCIS Impactor-Ⅲ脊髓撞击器制备大鼠急性 SCI 模型。连接及调试脊髓撞击器，选用质量为 10 g、直径 2.5 mm 的圆形撞击头，调整立体定位仪将撞击头对准显露的脊髓区域正中，调节对应撞击高度，拨动撞击开关，撞击头精确撞击 T10 节段脊髓后迅速抬起，可见硬脊膜下充血。移去撞击器，逐层缝合。急性 SCI 模型造模成功标准：撞击后可见大鼠痉挛性摆尾、双后肢抽动；麻醉清醒后 BBB 评分<4 分。所有动物均造模成功。
术后每天按摩大鼠膀胱 2 次直至恢复反射性排尿功能；每天皮下注射庆大霉素（0.05 mL/200 g）1 次，共 7 d。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验过程大鼠存活情况。
1.3.2 免疫荧光双染色观测
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各组取 4 只大鼠，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（60 mg/kg）深度麻醉后，置于冰上，经主动脉灌注冰 PBS 溶液至右心耳流出液清亮后，改为 4% 多聚甲醛灌注，直至大鼠四肢肌肉抽动、尾巴翘起。冰上操作，以损伤区域为中心截取 1 cm 长脊髓组织，置于 4% 多聚甲醛 6 h 后，转至 30% 蔗糖溶液、4℃ 过夜。常规脱水、透明、浸蜡、包埋及连续纵向切片（片厚 5 μm）。
各时间点检测微血管密度及炎症反应相关指标 RECA1 和 CD68，造模后 28 d 观察神经轴突及胶质细胞改变指标 NF-H 及 GFAP。具体操作：取部分石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、自发荧光淬灭、血清封闭后，滴加一抗 RECA1（1∶100）、CD68（1∶200）、NF-H（1∶100）、GFAP（1∶500），4℃ 孵育过夜；滴加相应二抗（1∶500），避光室温孵育 50 min。最后滴加 DAPI 染液复染细胞核，避光室温孵育 10 min 后封片、采集图像。
免疫荧光图像定量分析：将脊髓组织连续纵向切片编号 1～80 号，于 36～60 号切片按编号每 5 张选择 1 张进行观察。每张选中切片脊髓损伤部位随机选择 3 个 200 μm×200 μm 大小区域进行观察和分析。使用 Fiji image J 软件调节图像达到阳性颗粒最佳适配，软件记录并自动计算阳性面积，结果以阳性面积占总面积的百分比（阳性面积比）表示，定量分析 RECA1 和 CD68 的表达。
1.3.3 ELISA 检测脊髓 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平
造模后 12 h、24 h 及 3 d，各组取 3 只大鼠，同 1.3.2 方法处理后，以损伤区域为中心截取 0.6 cm 长脊髓组织。将组织置于 4℃ 裂解缓冲液中制备 10% 组织匀浆，以 1 500×g 离心 10 min。取上清液，参照 ELISA 试剂盒说明书检测。采用酶标仪于 450 nm 处测量吸光度（A）值，根据标准品浓度和 A 值绘制标准曲线，标准曲线方程计算样本浓度，结果以每毫克总蛋白中的目的蛋白量表示。实验重复 3 次。
1.3.4 组织学观察
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各组取 1.3.2 制备的部分切片行常规 HE 染色，光镜下观察脊髓组织结构完整性，出血、水肿及炎症细胞浸润情况。取 28 d 切片行尼氏体染色，切片常规脱蜡至水，浸入甲苯胺蓝溶液 5 min，0.1% 冰醋酸快速分化 1 s，自来水洗终止反应。光镜下控制分化程度至尼氏体呈深蓝色颗粒、背景呈浅蓝色。切片置于烤箱烤干，二甲苯透明 10 min，中性树胶封片，光镜下观察神经元及其尼氏体大小、形态、着色及数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方法分析，两两比较采用 LSD 法。组内 RECA1 与 CD68 表达相关性分析采用 Pearson 相关。微血管密度（RECA1）与炎症因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6）水平作 Spearman 秩相关性分析，其中微血管密度以 RECA1 阳性面积比定量数值为依据，计算各组造模后 12、24 h 及 7 d 均值，并按照从小到大转换成等级资料，微血管密度等级以 +、++、+++、++++ 表示。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验期间，中、重度损伤组各有 1、3 只大鼠因腹胀或感染死亡，均予以补充；其余大鼠均存活至实验完成。
2.2 免疫荧光双染色观测
2.2.1 微血管密度及炎症反应相关指标
① 免疫荧光染色显示，假手术组各时间点在 SCI 相应区域仅见 RECA1 和 CD68 微弱表达。轻、中、重度损伤组 SCI 后 12 h 时均可见明显的 RECA1 和 CD68 表达，随时间推移，上述指标表达逐渐增强，其中 RECA1 于 7 d 时表达最强，CD68 于 24 h 时表达最强，之后表达逐渐减弱。见图 1。
图1
各组 RECA1（绿色）和 CD68（红色）免疫荧光双染色观察 （正置荧光显微镜×40）
a. 假手术组术后 24 h；b. 轻度损伤组术后 12 h；c. 轻度损伤组术后 7 d；d. 中度损伤组术后 12 h；e. 中度损伤组术后 7 d；f. 重度损伤组术后 12 h；g. 重度损伤组术后 7 d
Figure1. DIF staining for RECA1 (green) and CD68 (red) in 4 groups (Fluorescence miroscopy×40)a. Sham group at 24 hours; b. Mild group at 12 hours; c. Mild group at 7 days; d. Moderate group at 12 hours; e. Moderate group at 7 days; f. Severe group at 12 hours; g. Severe group at 7 days
② 定量分析显示，RECA1 阳性面积比中度损伤组最大，之后依次为轻度损伤组、重度损伤组，假手术组最小；各时间点组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。CD68 阳性面积比重度损伤组最大，之后依次为中度损伤组、轻度损伤组，假手术组最小。除 24 h、28 d 轻度损伤组和中度损伤组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
免疫荧光定量分析各组 RECA1 和 CD68 阳性面积比（n=4，
，%）
Table1.
Immunofluorescent staining analysis for the ratios of RECA1 and CD68 positive areas in SCI regions (n=4, 
, %)
相关性分析显示，各时间点假手术组 RECA1 和 CD68 表达无相关（P>0.05）。SCI 后 12、24 h，轻、中度损伤组 RECA1 和 CD68 表达成正相关（P<0.05），重度损伤组二者无相关（P>0.05）。3 d 时，轻、中、重度损伤组 RECA1 和 CD68 表达均无相关（P>0.05）。7 d 时，轻、中度损伤组 RECA1 和 CD68 表达成负相关（P<0.05），重度损伤组二者无相关性（P=0.153）；28 d 时各损伤组 RECA1 和 CD68 表达均成负相关（P<0.05）。见表 2。
表2
各时间点各组 RECA1 和 CD68 表达相关性分析
Table2.
Correlation analysis of RECA1 and CD68 expressions at different time points
2.2.2 神经轴突及胶质细胞改变相关指标
免疫荧光染色显示，造模后 28 d 假手术组 SCI 相应区域 NF-H 染色阳性轴突呈连续性的细长条状结构，GFAP 染色阳性的星形胶质细胞可见多个长而分支的突起，呈放射状，另可见大量星形胶质细胞与轴突交错排列，形态规则；轻度损伤组可见星形胶质细胞增生，胶质瘢痕致密，而轴突连续性中断，形态短缩呈粗点状甚至融合成团，轴突较假手术组减少；中度损伤组星形胶质细胞突起变短，数量减少，形态不规则，轴突除类似轻度损伤组的改变外，数量明显减少；重度损伤组由于大量组织空洞形成，星形胶质细胞最少，胶质瘢痕致密，在损伤区域 NF-H 染色阳性的轴突稀少，未见连续性轴突存在。见图 2。
图2
造模后 28 d 各组 NF-H（红色）和 GFAP（绿色）免疫荧光双染色观察（正置荧光显微镜×20）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure2. DIF staining for NF-H (red) and GFAP (green) at 28 days after SCI (Fluorescence microscopy×20)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.3 ELISA 检测
假手术组各时间点 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均低于其他 3 组，差异有统计学意义（P<0.05）。中、重度损伤组 TNF-α 水平在 12 h 即达峰值，其余各组各炎症因子水平均在 24 h 达峰值。除 12 h 时轻、中度损伤组 IL-1β 水平差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组炎症因子水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
ELISA 检测各组 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平
a. TNF-α；b. IL-1β；c. IL-6
Figure3. TNF-α, IL-1β, and IL-6 levels in 4 groups detected by ELISA assaya. TNF-α; b. IL-1β; c. IL-6
基于 RECA1 阳性面积比定量数据，假手术组以及轻、中、重度损伤组 RECA1 阳性面积比均值依次为 1.34%、4.78%、7.22% 和 3.71%，微血管密度等级依次为 +、+++、++++ 和 ++，与 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平分别作秩相关性分析。结果表明，脊髓匀浆中 TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平与 SCI 区域微血管密度均成弱相关（r=0.412，P=0.000；r=0.416，P=0.000；r=0.382，P=0.000）。
2.4 组织学观察
2.4.1 HE 染色
各时间点假手术组脊髓形态正常，组织致密有序，灰、白质界限清楚，神经元外形规则、饱满、细胞核清晰。SCI 后 12 h，随损伤程度增加，脊髓肿胀、内出血及炎症细胞浸润逐级加重，灰、白质界限模糊，神经元胞体皱缩、细胞核碎裂甚至崩解消失；各损伤组随时间推移，组织肿胀、出血逐步加重，尤其重度损伤组大面积组织空洞出现，神经元消失。各损伤组 SCI 后 3、7 d，脊髓内红细胞、炎症细胞浸润逐渐减少，至 28 d 时表现为不同程度神经元残留及空洞形成，损伤程度越重，组织破坏越明显，空洞越大；各组红细胞及炎症细胞均少见。见图 4。
图4
造模后 12 h 各组 HE 染色观察（×10）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure4. HE staining for tissue structures in 4 groups at 12 hours after SCI (×10)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.4.2 尼氏体染色
造模后 28 d SCI 区域尼氏体染色显示，假手术组呈多边形或梭形的正常神经元，尼氏体呈蓝染、斑块状；轻度损伤组神经元减少，胞体缩小，尼氏体染色变浅、部分融合；中度损伤组上述病理改变加重；而重度损伤组极少见正常神经元结构，胞体缩小、分解，核固缩、崩裂，尼氏体完全融合甚至溶解。见图 5。
图5
造模后 28 d 各组尼氏体染色观察（×40）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure5. Nissl’s staining for neurons in 4 groups at 28 days after SCI (×40)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
3 讨论
SCI 后脊髓微血管的结构和功能会出现迅速且永久的改变，包括微循环丧失、血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）破坏、内皮细胞死亡和血管重塑[10]。这些改变加剧了脊髓继发性损害的程度，尤其是 BSCB 破坏，炎症细胞进入脊髓实质，加剧了炎症反应的程度。另外，内皮细胞死亡加剧血管网恶化，神经元及其他细胞因缺血而凋亡、坏死[11-12]。本研究中，我们应用 RECA1 作为血管内皮细胞的标记物，它不仅能显示受损塌陷的血管，还能显示血管萌芽及早期的内皮细胞迁移，可充分展现 SCI 后局部微血管密度的动态变化[13-14]。造模后 12 h，SCI 区域即可观察到 RECA1 阳性的内皮细胞表达增加，这可能与内皮细胞早期迁移有关[15]。本研究结果表明，不论何种程度的 SCI 均可启发自身的血管再生修复机制，但程度不同。分析原因可能为：① SCI 在一定程度之内，自身血管新生重建随着致伤程度加重而增加；② SCI 程度超过机体自我修复能力之外时，组织结构极大破坏，血管新生遭受明显抑制。损伤后期随着脊髓内空洞形成及血管网重构结束，增生的血管因重塑而吸收减少，这与我们之前报道的脊髓半切模型的血管研究结果类似[16]。
炎症是免疫系统对创伤的反应，可在损伤数分钟内开始，持续数天、数月甚至更久。神经炎症在脊髓继发性损伤中的作用是双刃剑，既通过支持神经再生获益，也会放大局部破坏作用产生危害[17]。SCI 后小胶质细胞被激活，释放趋化因子、细胞因子和其他炎症介质，募集外周血中的中性粒细胞和巨噬细胞进入损伤区域。而活化的小胶质细胞在形态和功能上均与循环血中的巨噬细胞类似[18-19]。巨噬细胞在微环境中通过释放蛋白水解酶、活性氧和炎症因子（包括 INF、TNF 和其他炎症介质等）加重炎症损伤，也发挥清除细胞碎片、细胞重塑和产生促再生因子的功能[20]。本研究选择 CD68 作为观察炎症反应的标记物，可显示活化的小胶质细胞和巨噬细胞[21]。CD68 表达分析表明，SCI 后各组炎症反应随时间延长发生变化，造模后 24 h 是细胞表达的高峰；且小胶质细胞活化/巨噬细胞浸润程度与 SCI 程度大致平行，即损伤程度越重，炎症反应越剧烈。ELISA 测定的炎症因子水平证实了炎症反应与损伤程度的平行关系。
相关性分析揭示了不同程度 SCI 后血管重构与炎症反应之间均有内在规律可循。TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均与 SCI 区域微血管密度存在相关关系；CD68 与 RECA1 表达的相关分析展现了具体的关联细节。SCI 后 12、24 h，轻、中度损伤组新生血管越丰富，则可见越多的炎症细胞浸润，提示损伤急性期，内皮细胞迁移可带来大量炎症细胞浸润。而重度损伤组二者无明显相关性。这种现象可能与重度 SCI 造成血管新生障碍，且 BSCB 破坏，大量炎症细胞浸润有关。SCI 后 7、28 d，除 7 d 时重度损伤组外，均可见局部新生血管越丰富、炎症细胞浸润越少。究其原因，可能为 SCI 后期血管重构完毕，丰富的血管有助于清除巨噬细胞吞噬的细胞碎片及组织残渣。而血管重构与炎症反应作为相互关联、相互影响的两个方面，上述结果亦可反映炎症反应对血管新生的作用。据报道，炎症反应对血管新生的作用是双向的[22]。巨噬细胞及其他炎症细胞可释放促血管相关细胞因子，如 VEGF 对血管内皮细胞迁移、重组起促进作用，我们的研究结果亦提示在轻、中度 SCI 模型中，可见到血管密度随着损伤程度上升而增加；而重度的炎症反应则抑制血管新生，这可能与炎症介质过度释放，大量组织细胞凋亡、崩解，微血管阻塞有关，同时早期的内皮细胞迁移受到抑制[23]。重度损伤模型中，反而见到比轻、中度损伤更低的微血管密度。掌握以上血管新生、重构与炎症反应之间的关系，可为以微血管或炎症反应为靶点的 SCI 研究提供参考，如微血管干预中出现过激的炎症表现，或炎症干预中出现微血管新生迟缓，则提示干预措施未达预期。
血管新生速度、炎症反应程度及其相关关系，均对 SCI 远期的神经组织完整性和神经纤维束的连续性造成直接影响。血管重构过程越快完善，对炎症反应的抑制作用越明显，炎症损害程度越轻微，相应的组织修复能力就越强；另一方面，炎症反应轻微，血管网的损害程度越低，即使局部微血管密度不大，组织结构也能得到较好保留，表现为胶质瘢痕生长受到遏制，轴突连续性恢复，空洞形成较小[24]。组织学分析表明，SCI 后脊髓组织结构的破坏与损伤程度相关，早期表现为组织肿胀、局部出血和炎症细胞浸润，后期表现为组织空洞形成，尤其在重度损伤组，灰/白质界限完全消失，几乎不可见正常的神经元结构。另外，重度损伤组大量组织空洞形成，胶质瘢痕致密，轴突稀少，未见连续性轴突结构存在。组织学研究提示，轻度损伤的 SCI 有部分自主修复能力，而重度损伤 SCI 由于脊髓组织的大量破坏和神经元、轴突广泛坏死及致密胶质瘢痕的形成，严重阻碍自主神经修复。因此，SCI 研究选择损伤程度时，可以充分考虑上述结果，例如重度 SCI 可能导致不可逆的损伤，从而使干预治疗措施产生假阴性结果。
作者贡献：许子星负责实验设计、实施、数据收集分析及论文撰写；许卫红对文章的知识性内容作批评性审阅；陈薛敏、周亦楠参与研究实施过程，包括动物实验、标本取材及检测。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经福建医科大学实验动物伦理委员会批准（FJMU IACUC 2018-046）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2016-0006。
急性脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后，微血管破裂、神经元损害、脱髓鞘改变会引发一系列病理过程，包括炎症细胞浸润、炎症介质释放和胶质瘢痕形成等，从而抑制组织再生和功能恢复[1-2]。微血管网破坏和炎症反应是 SCI 病理过程中至关重要的两个环节。一项基于自身免疫性脊髓炎动物模型的研究发现，新生血管环绕炎症反应区域，随后邻近血管的皮质脊髓束纤维萌生[3]。这一现象提示微血管网破坏及炎症反应两种病理状态相互关联，是 SCI 后干预治疗的重要靶点。研究证实，微血管在 SCI 后 3 d 内即出现于损伤区域，其密度峰值可达正常的 5 倍以上[4]。普遍认为，内皮细胞可作为吞噬细胞吞噬大颗粒、髓鞘碎片和凋亡细胞等，有助于清除蓄积物而减轻炎症反应。换句话说，一方面微循环障碍是炎症性损害加剧的诱因；另一方面，过度的炎症性损害是阻碍微循环重建的不利因素，二者互为因果，恶性循环终致神经修复障碍和功能丧失[3, 5]。
研究表明，促进微血管网重建，既有望抑制炎症反应，又有利于神经修复[6]。因此揭示微血管重构的动态过程与炎症反应之间的关系，有助于理解 SCI 后极其复杂的病理过程，对 SCI 精准治疗具有重要意义。我们前期研究证实，以改善血管重构为目的的治疗能够减少炎症细胞浸润，促进轴突再生及功能恢复[7]。然而，SCI 发生后，微血管网破坏及重建的动态过程，及其与炎症反应、炎症因子表达的关系尚无深入研究报道。以此为切入点，本研究拟探索不同程度 SCI 后损伤区域微血管密度变化趋势，及其与炎症指标相关关系，研究微血管重构、炎症反应与脊髓组织结构变化转归的关系，旨在为 SCI 研究提供一个血管-炎症模型，为动物造模和靶点治疗提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年雌性 SD 大鼠 116 只，体质量 230～250 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠抗大鼠内皮细胞抗原 1（rat endothelial cell antigen 1，RECA1）抗体、兔抗 CD68 抗体、小鼠抗神经微丝（neurofilament-H，NF-H）抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（Abcam 公司，美国）；Alexa568/Alexa488 山羊抗小鼠（或兔）荧光二抗（Invitrogen 公司，美国）；TNF-α、IL-1β、IL-6 的 ELISA 试剂盒（Cusabio 公司，美国）；甲苯胺蓝染液（武汉赛维尔生物技术有限公司）。
MASCIS Impactor-Ⅲ 脊髓撞击器（纽约大学 W.M.Keck 神经科学研究中心，美国）。全自动酶联免疫吸附分析仪（BioTek 公司，美国）；正置荧光显微镜及 DS-U3 成像系统（Nikon 公司，日本）；切片扫描及 Caseviewer2.0 成像系统（Pannoramic 250；3D HISTECH 公司，匈牙利）；Fiji image J 软件（美国国立卫生研究院）。
1.2 实验分组及方法
将 116 只大鼠随机分为 4 组，每组 29 只。假手术组仅切除椎板暴露脊髓，不进行撞击；轻度损伤组以 12.5 mm 高度撞击脊髓；中度损伤组以 25.0 mm 高度撞击脊髓；重度损伤组以 50.0 mm 高度撞击脊髓[8-9]。
各组大鼠采用腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（30～40 mg/kg）麻醉后，背部常规消毒、铺巾。以 T9～11 棘突为中心，纵向切开长约 3 cm 皮肤，分离背部肌肉，暴露 T9～11 椎板及棘突。用显微咬骨钳咬除 T9～11 椎体棘突，咬除 T10 全椎板，充分暴露脊髓。假手术组直接缝合切口，轻、中、重度损伤组采用 MASCIS Impactor-Ⅲ脊髓撞击器制备大鼠急性 SCI 模型。连接及调试脊髓撞击器，选用质量为 10 g、直径 2.5 mm 的圆形撞击头，调整立体定位仪将撞击头对准显露的脊髓区域正中，调节对应撞击高度，拨动撞击开关，撞击头精确撞击 T10 节段脊髓后迅速抬起，可见硬脊膜下充血。移去撞击器，逐层缝合。急性 SCI 模型造模成功标准：撞击后可见大鼠痉挛性摆尾、双后肢抽动；麻醉清醒后 BBB 评分<4 分。所有动物均造模成功。
术后每天按摩大鼠膀胱 2 次直至恢复反射性排尿功能；每天皮下注射庆大霉素（0.05 mL/200 g）1 次，共 7 d。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察实验过程大鼠存活情况。
1.3.2 免疫荧光双染色观测
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各组取 4 只大鼠，腹腔注射 3% 戊巴比妥钠（60 mg/kg）深度麻醉后，置于冰上，经主动脉灌注冰 PBS 溶液至右心耳流出液清亮后，改为 4% 多聚甲醛灌注，直至大鼠四肢肌肉抽动、尾巴翘起。冰上操作，以损伤区域为中心截取 1 cm 长脊髓组织，置于 4% 多聚甲醛 6 h 后，转至 30% 蔗糖溶液、4℃ 过夜。常规脱水、透明、浸蜡、包埋及连续纵向切片（片厚 5 μm）。
各时间点检测微血管密度及炎症反应相关指标 RECA1 和 CD68，造模后 28 d 观察神经轴突及胶质细胞改变指标 NF-H 及 GFAP。具体操作：取部分石蜡切片脱蜡至水、抗原修复、自发荧光淬灭、血清封闭后，滴加一抗 RECA1（1∶100）、CD68（1∶200）、NF-H（1∶100）、GFAP（1∶500），4℃ 孵育过夜；滴加相应二抗（1∶500），避光室温孵育 50 min。最后滴加 DAPI 染液复染细胞核，避光室温孵育 10 min 后封片、采集图像。
免疫荧光图像定量分析：将脊髓组织连续纵向切片编号 1～80 号，于 36～60 号切片按编号每 5 张选择 1 张进行观察。每张选中切片脊髓损伤部位随机选择 3 个 200 μm×200 μm 大小区域进行观察和分析。使用 Fiji image J 软件调节图像达到阳性颗粒最佳适配，软件记录并自动计算阳性面积，结果以阳性面积占总面积的百分比（阳性面积比）表示，定量分析 RECA1 和 CD68 的表达。
1.3.3 ELISA 检测脊髓 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平
造模后 12 h、24 h 及 3 d，各组取 3 只大鼠，同 1.3.2 方法处理后，以损伤区域为中心截取 0.6 cm 长脊髓组织。将组织置于 4℃ 裂解缓冲液中制备 10% 组织匀浆，以 1 500×g 离心 10 min。取上清液，参照 ELISA 试剂盒说明书检测。采用酶标仪于 450 nm 处测量吸光度（A）值，根据标准品浓度和 A 值绘制标准曲线，标准曲线方程计算样本浓度，结果以每毫克总蛋白中的目的蛋白量表示。实验重复 3 次。
1.3.4 组织学观察
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各组取 1.3.2 制备的部分切片行常规 HE 染色，光镜下观察脊髓组织结构完整性，出血、水肿及炎症细胞浸润情况。取 28 d 切片行尼氏体染色，切片常规脱蜡至水，浸入甲苯胺蓝溶液 5 min，0.1% 冰醋酸快速分化 1 s，自来水洗终止反应。光镜下控制分化程度至尼氏体呈深蓝色颗粒、背景呈浅蓝色。切片置于烤箱烤干，二甲苯透明 10 min，中性树胶封片，光镜下观察神经元及其尼氏体大小、形态、着色及数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方法分析，两两比较采用 LSD 法。组内 RECA1 与 CD68 表达相关性分析采用 Pearson 相关。微血管密度（RECA1）与炎症因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6）水平作 Spearman 秩相关性分析，其中微血管密度以 RECA1 阳性面积比定量数值为依据，计算各组造模后 12、24 h 及 7 d 均值，并按照从小到大转换成等级资料，微血管密度等级以 +、++、+++、++++ 表示。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
实验期间，中、重度损伤组各有 1、3 只大鼠因腹胀或感染死亡，均予以补充；其余大鼠均存活至实验完成。
2.2 免疫荧光双染色观测
2.2.1 微血管密度及炎症反应相关指标
① 免疫荧光染色显示，假手术组各时间点在 SCI 相应区域仅见 RECA1 和 CD68 微弱表达。轻、中、重度损伤组 SCI 后 12 h 时均可见明显的 RECA1 和 CD68 表达，随时间推移，上述指标表达逐渐增强，其中 RECA1 于 7 d 时表达最强，CD68 于 24 h 时表达最强，之后表达逐渐减弱。见图 1。
图1
各组 RECA1（绿色）和 CD68（红色）免疫荧光双染色观察 （正置荧光显微镜×40）
a. 假手术组术后 24 h；b. 轻度损伤组术后 12 h；c. 轻度损伤组术后 7 d；d. 中度损伤组术后 12 h；e. 中度损伤组术后 7 d；f. 重度损伤组术后 12 h；g. 重度损伤组术后 7 d
Figure1. DIF staining for RECA1 (green) and CD68 (red) in 4 groups (Fluorescence miroscopy×40)a. Sham group at 24 hours; b. Mild group at 12 hours; c. Mild group at 7 days; d. Moderate group at 12 hours; e. Moderate group at 7 days; f. Severe group at 12 hours; g. Severe group at 7 days
② 定量分析显示，RECA1 阳性面积比中度损伤组最大，之后依次为轻度损伤组、重度损伤组，假手术组最小；各时间点组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。CD68 阳性面积比重度损伤组最大，之后依次为中度损伤组、轻度损伤组，假手术组最小。除 24 h、28 d 轻度损伤组和中度损伤组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
免疫荧光定量分析各组 RECA1 和 CD68 阳性面积比（n=4，，%）
Table1.
Immunofluorescent staining analysis for the ratios of RECA1 and CD68 positive areas in SCI regions (n=4, , %)
相关性分析显示，各时间点假手术组 RECA1 和 CD68 表达无相关（P>0.05）。SCI 后 12、24 h，轻、中度损伤组 RECA1 和 CD68 表达成正相关（P<0.05），重度损伤组二者无相关（P>0.05）。3 d 时，轻、中、重度损伤组 RECA1 和 CD68 表达均无相关（P>0.05）。7 d 时，轻、中度损伤组 RECA1 和 CD68 表达成负相关（P<0.05），重度损伤组二者无相关性（P=0.153）；28 d 时各损伤组 RECA1 和 CD68 表达均成负相关（P<0.05）。见表 2。
表2
各时间点各组 RECA1 和 CD68 表达相关性分析
Table2.
Correlation analysis of RECA1 and CD68 expressions at different time points
2.2.2 神经轴突及胶质细胞改变相关指标
免疫荧光染色显示，造模后 28 d 假手术组 SCI 相应区域 NF-H 染色阳性轴突呈连续性的细长条状结构，GFAP 染色阳性的星形胶质细胞可见多个长而分支的突起，呈放射状，另可见大量星形胶质细胞与轴突交错排列，形态规则；轻度损伤组可见星形胶质细胞增生，胶质瘢痕致密，而轴突连续性中断，形态短缩呈粗点状甚至融合成团，轴突较假手术组减少；中度损伤组星形胶质细胞突起变短，数量减少，形态不规则，轴突除类似轻度损伤组的改变外，数量明显减少；重度损伤组由于大量组织空洞形成，星形胶质细胞最少，胶质瘢痕致密，在损伤区域 NF-H 染色阳性的轴突稀少，未见连续性轴突存在。见图 2。
图2
造模后 28 d 各组 NF-H（红色）和 GFAP（绿色）免疫荧光双染色观察（正置荧光显微镜×20）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure2. DIF staining for NF-H (red) and GFAP (green) at 28 days after SCI (Fluorescence microscopy×20)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.3 ELISA 检测
假手术组各时间点 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均低于其他 3 组，差异有统计学意义（P<0.05）。中、重度损伤组 TNF-α 水平在 12 h 即达峰值，其余各组各炎症因子水平均在 24 h 达峰值。除 12 h 时轻、中度损伤组 IL-1β 水平差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组炎症因子水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
ELISA 检测各组 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平
a. TNF-α；b. IL-1β；c. IL-6
Figure3. TNF-α, IL-1β, and IL-6 levels in 4 groups detected by ELISA assaya. TNF-α; b. IL-1β; c. IL-6
基于 RECA1 阳性面积比定量数据，假手术组以及轻、中、重度损伤组 RECA1 阳性面积比均值依次为 1.34%、4.78%、7.22% 和 3.71%，微血管密度等级依次为 +、+++、++++ 和 ++，与 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平分别作秩相关性分析。结果表明，脊髓匀浆中 TNF-α、IL-1β、IL-6 表达水平与 SCI 区域微血管密度均成弱相关（r=0.412，P=0.000；r=0.416，P=0.000；r=0.382，P=0.000）。
2.4 组织学观察
2.4.1 HE 染色
各时间点假手术组脊髓形态正常，组织致密有序，灰、白质界限清楚，神经元外形规则、饱满、细胞核清晰。SCI 后 12 h，随损伤程度增加，脊髓肿胀、内出血及炎症细胞浸润逐级加重，灰、白质界限模糊，神经元胞体皱缩、细胞核碎裂甚至崩解消失；各损伤组随时间推移，组织肿胀、出血逐步加重，尤其重度损伤组大面积组织空洞出现，神经元消失。各损伤组 SCI 后 3、7 d，脊髓内红细胞、炎症细胞浸润逐渐减少，至 28 d 时表现为不同程度神经元残留及空洞形成，损伤程度越重，组织破坏越明显，空洞越大；各组红细胞及炎症细胞均少见。见图 4。
图4
造模后 12 h 各组 HE 染色观察（×10）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure4. HE staining for tissue structures in 4 groups at 12 hours after SCI (×10)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.4.2 尼氏体染色
造模后 28 d SCI 区域尼氏体染色显示，假手术组呈多边形或梭形的正常神经元，尼氏体呈蓝染、斑块状；轻度损伤组神经元减少，胞体缩小，尼氏体染色变浅、部分融合；中度损伤组上述病理改变加重；而重度损伤组极少见正常神经元结构，胞体缩小、分解，核固缩、崩裂，尼氏体完全融合甚至溶解。见图 5。
图5
造模后 28 d 各组尼氏体染色观察（×40）
a. 假手术组；b. 轻度损伤组；c. 中度损伤组；d. 重度损伤组
Figure5. Nissl’s staining for neurons in 4 groups at 28 days after SCI (×40)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
3 讨论
SCI 后脊髓微血管的结构和功能会出现迅速且永久的改变，包括微循环丧失、血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）破坏、内皮细胞死亡和血管重塑[10]。这些改变加剧了脊髓继发性损害的程度，尤其是 BSCB 破坏，炎症细胞进入脊髓实质，加剧了炎症反应的程度。另外，内皮细胞死亡加剧血管网恶化，神经元及其他细胞因缺血而凋亡、坏死[11-12]。本研究中，我们应用 RECA1 作为血管内皮细胞的标记物，它不仅能显示受损塌陷的血管，还能显示血管萌芽及早期的内皮细胞迁移，可充分展现 SCI 后局部微血管密度的动态变化[13-14]。造模后 12 h，SCI 区域即可观察到 RECA1 阳性的内皮细胞表达增加，这可能与内皮细胞早期迁移有关[15]。本研究结果表明，不论何种程度的 SCI 均可启发自身的血管再生修复机制，但程度不同。分析原因可能为：① SCI 在一定程度之内，自身血管新生重建随着致伤程度加重而增加；② SCI 程度超过机体自我修复能力之外时，组织结构极大破坏，血管新生遭受明显抑制。损伤后期随着脊髓内空洞形成及血管网重构结束，增生的血管因重塑而吸收减少，这与我们之前报道的脊髓半切模型的血管研究结果类似[16]。
炎症是免疫系统对创伤的反应，可在损伤数分钟内开始，持续数天、数月甚至更久。神经炎症在脊髓继发性损伤中的作用是双刃剑，既通过支持神经再生获益，也会放大局部破坏作用产生危害[17]。SCI 后小胶质细胞被激活，释放趋化因子、细胞因子和其他炎症介质，募集外周血中的中性粒细胞和巨噬细胞进入损伤区域。而活化的小胶质细胞在形态和功能上均与循环血中的巨噬细胞类似[18-19]。巨噬细胞在微环境中通过释放蛋白水解酶、活性氧和炎症因子（包括 INF、TNF 和其他炎症介质等）加重炎症损伤，也发挥清除细胞碎片、细胞重塑和产生促再生因子的功能[20]。本研究选择 CD68 作为观察炎症反应的标记物，可显示活化的小胶质细胞和巨噬细胞[21]。CD68 表达分析表明，SCI 后各组炎症反应随时间延长发生变化，造模后 24 h 是细胞表达的高峰；且小胶质细胞活化/巨噬细胞浸润程度与 SCI 程度大致平行，即损伤程度越重，炎症反应越剧烈。ELISA 测定的炎症因子水平证实了炎症反应与损伤程度的平行关系。
相关性分析揭示了不同程度 SCI 后血管重构与炎症反应之间均有内在规律可循。TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均与 SCI 区域微血管密度存在相关关系；CD68 与 RECA1 表达的相关分析展现了具体的关联细节。SCI 后 12、24 h，轻、中度损伤组新生血管越丰富，则可见越多的炎症细胞浸润，提示损伤急性期，内皮细胞迁移可带来大量炎症细胞浸润。而重度损伤组二者无明显相关性。这种现象可能与重度 SCI 造成血管新生障碍，且 BSCB 破坏，大量炎症细胞浸润有关。SCI 后 7、28 d，除 7 d 时重度损伤组外，均可见局部新生血管越丰富、炎症细胞浸润越少。究其原因，可能为 SCI 后期血管重构完毕，丰富的血管有助于清除巨噬细胞吞噬的细胞碎片及组织残渣。而血管重构与炎症反应作为相互关联、相互影响的两个方面，上述结果亦可反映炎症反应对血管新生的作用。据报道，炎症反应对血管新生的作用是双向的[22]。巨噬细胞及其他炎症细胞可释放促血管相关细胞因子，如 VEGF 对血管内皮细胞迁移、重组起促进作用，我们的研究结果亦提示在轻、中度 SCI 模型中，可见到血管密度随着损伤程度上升而增加；而重度的炎症反应则抑制血管新生，这可能与炎症介质过度释放，大量组织细胞凋亡、崩解，微血管阻塞有关，同时早期的内皮细胞迁移受到抑制[23]。重度损伤模型中，反而见到比轻、中度损伤更低的微血管密度。掌握以上血管新生、重构与炎症反应之间的关系，可为以微血管或炎症反应为靶点的 SCI 研究提供参考，如微血管干预中出现过激的炎症表现，或炎症干预中出现微血管新生迟缓，则提示干预措施未达预期。
血管新生速度、炎症反应程度及其相关关系，均对 SCI 远期的神经组织完整性和神经纤维束的连续性造成直接影响。血管重构过程越快完善，对炎症反应的抑制作用越明显，炎症损害程度越轻微，相应的组织修复能力就越强；另一方面，炎症反应轻微，血管网的损害程度越低，即使局部微血管密度不大，组织结构也能得到较好保留，表现为胶质瘢痕生长受到遏制，轴突连续性恢复，空洞形成较小[24]。组织学分析表明，SCI 后脊髓组织结构的破坏与损伤程度相关，早期表现为组织肿胀、局部出血和炎症细胞浸润，后期表现为组织空洞形成，尤其在重度损伤组，灰/白质界限完全消失，几乎不可见正常的神经元结构。另外，重度损伤组大量组织空洞形成，胶质瘢痕致密，轴突稀少，未见连续性轴突结构存在。组织学研究提示，轻度损伤的 SCI 有部分自主修复能力，而重度损伤 SCI 由于脊髓组织的大量破坏和神经元、轴突广泛坏死及致密胶质瘢痕的形成，严重阻碍自主神经修复。因此，SCI 研究选择损伤程度时，可以充分考虑上述结果，例如重度 SCI 可能导致不可逆的损伤，从而使干预治疗措施产生假阴性结果。
作者贡献：许子星负责实验设计、实施、数据收集分析及论文撰写；许卫红对文章的知识性内容作批评性审阅；陈薛敏、周亦楠参与研究实施过程，包括动物实验、标本取材及检测。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经福建医科大学实验动物伦理委员会批准（FJMU IACUC 2018-046）。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2016-0006。
