引用本文： 吴元刚, 曾羿, 李明阳, 刘渊, 杨静, 沈彬. 不同阶段骨关节炎滑膜组织中肾素、血管紧张素转换酶及血管紧张素受体 1、2 的表达研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(3): 362-366. doi: 10.7507/1002-1892.201904065 复制
骨关节炎是临床常见慢性关节疾病之一，研究表明炎性介质的参与是骨关节炎发生的重要因素[1-2]，例如 TNF-α、IL-6、 IL-β 可以造成软骨进行性变性，甚至引起软骨细胞死亡和细胞外基质的丢失[3-6]。
肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin-system，RAS）包括肾素（Renin）[7]、血管紧张素 Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）[8]、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）[9]和血管紧张素受体 1（angiotensin receptor 1，AT1R）、AT2R[10]等，其作为激素系统调节血压和体液内环境稳定已经被研究证实。近年来，研究发现 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 在人和动物的滑膜组织中表达，并参与骨关节炎的发生[11]。同时，在急性和慢性骨关节炎动物模型中，ACE 抑制剂喹那普利能减少关节内 TNF-α 的产生，具有抗炎特性，能够抑制胶原酶诱导的关节炎的发生、发展[12-13]。因此，Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 是关节退变过程中重要介质。本研究旨在分析不同阶段骨关节炎患者滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 表达差异，为进一步阐明骨关节炎发病机制以及为该病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象及标本处理
以 2018 年 1 月—12 月因创伤行膝上截肢术、骨关节炎行人工全膝关节置换术的患者作为研究对象。骨关节炎患者均按照 1995 年美国风湿病学会（ARA）制定的诊断标准确诊。排除标准：① 类风湿性关节炎、痛风性关节炎等其他关节炎性疾病；② 合并严重心、脑、肝、肾等重要脏器病变；③ 近 3 个月有关节腔注射史。
共 32 例患者符合选择标准纳入研究，根据 Kellgren-Lawrence（K-L）X 线分级标准[14]分为正常滑膜组（A 组，9 例）、中度骨关节炎滑膜组（B 组，11 例，K-L 3 级）及晚期骨关节炎滑膜组（C 组，12 例，K-L 4 级）。其中，A 组男 5 例，女 4 例；年龄 21～35 岁，平均 27.7 岁；B 组男 4 例，女 7 例；年龄 54～61 岁，平均 57.3 岁； C 组男 5 例，女 7 例；年龄 62～68 岁，平均 64.6 岁。术中取滑膜组织标本，无菌环境中 PBS 冲洗 3 次， 然后剪成 1 cm×1 cm 大小组织块，备用。
1.2 主要试剂及仪器
TRIzol 试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；TaqMan 反转录试剂盒（Biosystems 公司，美国）；SYBR Green Ⅰ PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）；BCA 蛋白定量试剂盒、化学发光试剂显影免疫复合物 （Bio-Rad 公司，美国）。ABI 7300 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.3 观测指标
1.3.1 实时荧光定量 PCR 检测
取各组滑膜组织标本用 TRIzol 溶液提取总 RNA，然后按试剂盒说明书逆转录成 cDNA，将目的基因进行转录扩增，反应条件：94℃ 预变性 2 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，总共循环 50 次。PCR 引物序列见表 1。按照 2−ΔΔCt 值计算法，以 GAPDH 为内参，计算 Renin、ACE、AT1R 及 AT2R mRNA 相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3.2 Western blot 检测
取各组滑膜组织标本置于 RIPA 缓冲液中进行匀浆，4℃ 以离心半径 5 cm、13 000 r/min 离心 15 min，取上清；采用 BCA 蛋白试剂盒测定总蛋白浓度。使用 12%SDS-PAGE 分离总蛋白，并在 250 mA、2 h 条件下将蛋白转移到硝酸纤维素膜。室温下，将膜置于含 5% 脱脂牛奶的 TBST 封闭 1.5 h； 4℃ 下与 Renin（1∶1 000）、ACE（1∶1 000）、AT1R（1∶1 000）、AT2R（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育过夜；与相应的抗兔/抗鼠二抗孵育 1.5 h。将条带与化学发光试剂显影免疫复合物结合观察，采用 Image J 软件分析灰度值。以与 GAPDH 条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
B、C 组 Renin、ACE、AT1R mRNA 及蛋白相对表达量明显高于 A 组，C 组 ACE、AT1R mRNA 及蛋白相对表达量以及 Renin 蛋白相对表达量明显高于 B 组；B、C 组 AT2R mRNA 及蛋白相对表达量明显低于 A 组，C 组低于 B 组。上述指标组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1、2。
图1
实时荧光定量 PCR 检测 3 组滑膜组织中 Renin、ACE、 AT1R 和 AT2R mRNA 表达
Figure1.
The mRNA expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by qRT-PCR
图2
Western blot 检测 3 组滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 蛋白表达
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组；b、c. 目的蛋白相对表达量
Figure2. The protein expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B3: Group C; b, c. Target protein relative expression
3 讨论
研究证实，骨关节炎病理改变主要为软骨细胞增生肥大、软骨基质分离降解和软骨下骨血管增生[15]。Kawakami 等[16]的研究对骨关节炎软骨细胞进行分离培养，经实时荧光定量 PCR 检测证实软骨细胞表达 RAS 中的血管紧张素受体，且在 IL-1 刺激下表达有增高趋势，说明 RAS 成分参与了骨关节炎病理过程中的炎症反应。Tsukamoto 等[17]报道骨关节炎软骨细胞增生肥大与 RAS 中的血管紧张素受体有关。上述研究结果提示软骨内局部 RAS 与骨关节炎的病理改变相关，其关键位点可能成为骨关节炎防治新靶点。
ACE 是 RAS 系统中的关键酶，可以催化 AngⅠ 转化为 AngⅡ，参与骨关节炎病理过程[18]。本研究实时荧光定量 PCR 以及 Western blot 检测结果显示，中、晚期骨关节炎滑膜组织中的 ACE 表达水平明显高于正常人群。既往研究报道骨关节炎患者滑膜组织中存在 ACE 且表达呈上调趋势，促进血管生成，造成骨关节炎的病理发展[18]。而 ACE 抑制剂能抑制 NF-κB 和炎症因子（如 TNF-α 和 IL-1β）能力，因此使用 ACE 抑制剂能够延缓骨关节炎的发展[18-19]。Martin 等[19]通过临床试验评估了 ACE 抑制剂卡托普利治疗类风湿性关节炎的效果。该研究包括 15 例活动性类风湿性关节炎患者，经随访 48 周，10 例患者类风湿性关节炎临床症状改善，包括关节疼痛缓解和关节肿胀减轻；24、48 周时炎症因子 C 反应蛋白水平也降低。上述研究结果说明，通过抑制 RAS 中 ACE 的关键靶点，可能是防治骨关节炎病理进展的新方法。
本研究还发现，中、晚期骨关节炎滑膜组织中 AT1R 表达水平明显高于正常人群。研究证实[20]，AngⅡ 对各种组织和器官的调控作用主要是通过 AT1R 和 AT2R 完成的，其中 AT1R 介导大多数 AngⅡ 功能，滑膜组织产生的 AngⅡ 通过作用于滑膜 AT1R，调节滑膜灌注和生长，影响关节炎发生、发展。本研究还发现随着 K-L 分级增加，滑膜组织中 AT1R 表达水平逐渐提高。Silveira 等[21]发现骨关节炎大鼠 AT1R 和 ACE 表达显著增强，但是使用氯沙坦干预后局部炎症反应降低，骨关节炎相关的组织学变化得到改善。同时，Silveira 等还观察到氯沙坦可减少中性粒细胞的募集，减少 TNF-α 和 IL-1β 的产生，并直接抑制白细胞-内皮细胞的相互作用。以上研究均表明抑制关节炎局部的 RAS 关键靶点，能够延缓骨关节炎的进展。
另外，随着骨关节炎 K-L 分级增加，膝关节滑膜组织中 AT1R 表达逐渐增加，但是 AT2R 表达逐渐降低，分析原因为在多种组织和器官中，AngⅡ 可通过 AT1R 发挥其类似细胞因子的作用[22-23]，随着骨关节炎严重程度增加，滑膜组织中 AT1R 水平提高，促进血管生成，造成软骨破坏；阻断 AT1R 后，增强的 Ang Ⅱ 水平可导致 AT2R 活性增加，而 AT2R 作用被认为与 AT1R 相反，因此增加 AT2R 表达能够潜在诱导抗炎机制激活，从而延缓关节炎进展。Tang 等[24]的研究显示，与假手术组相比，骨关节炎组大鼠胫骨近端 AT1R mRNA 和蛋白相对表达量增加，而 AT2R mRNA 和蛋白表达下降。此外，与单纯骨关节炎组相比，卡托普利治疗的骨关节炎组 AT2R 表达增加而 AT1R 表达减少。另外，Sagawa 等[25]报道，血管紧张素受体抑制剂奥美沙坦能抑制胶原酶诱导的骨关节炎的发展，研究发现奥美沙坦显著抑制了小鼠淋巴细胞增殖和 IFN-γ 的产生。因此，AT2R 激动剂具有作为治疗炎症和免疫疾病药物的潜力。
综上述，本研究发现随着骨关节炎加重，关节滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 表达量显著高于正常人群，AT2R 表达量呈下降趋势，说明滑膜组织中 RAS 系统相关组分与骨关节炎发展相关，为骨关节炎的早期预测以及干预提供了新思路。
作者贡献：吴元刚负责文章撰写及临床标本收集，李明阳和刘渊负责数据收集整理及统计分析，杨静负责临床标本收集，沈彬和曾羿负责科研设计、对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经四川大学华西医院医学伦理委员会批准（201302007）。患者均签署知情同意书。
骨关节炎是临床常见慢性关节疾病之一，研究表明炎性介质的参与是骨关节炎发生的重要因素[1-2]，例如 TNF-α、IL-6、 IL-β 可以造成软骨进行性变性，甚至引起软骨细胞死亡和细胞外基质的丢失[3-6]。
肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin-system，RAS）包括肾素（Renin）[7]、血管紧张素 Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）[8]、血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）[9]和血管紧张素受体 1（angiotensin receptor 1，AT1R）、AT2R[10]等，其作为激素系统调节血压和体液内环境稳定已经被研究证实。近年来，研究发现 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 在人和动物的滑膜组织中表达，并参与骨关节炎的发生[11]。同时，在急性和慢性骨关节炎动物模型中，ACE 抑制剂喹那普利能减少关节内 TNF-α 的产生，具有抗炎特性，能够抑制胶原酶诱导的关节炎的发生、发展[12-13]。因此，Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 是关节退变过程中重要介质。本研究旨在分析不同阶段骨关节炎患者滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 表达差异，为进一步阐明骨关节炎发病机制以及为该病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象及标本处理
以 2018 年 1 月—12 月因创伤行膝上截肢术、骨关节炎行人工全膝关节置换术的患者作为研究对象。骨关节炎患者均按照 1995 年美国风湿病学会（ARA）制定的诊断标准确诊。排除标准：① 类风湿性关节炎、痛风性关节炎等其他关节炎性疾病；② 合并严重心、脑、肝、肾等重要脏器病变；③ 近 3 个月有关节腔注射史。
共 32 例患者符合选择标准纳入研究，根据 Kellgren-Lawrence（K-L）X 线分级标准[14]分为正常滑膜组（A 组，9 例）、中度骨关节炎滑膜组（B 组，11 例，K-L 3 级）及晚期骨关节炎滑膜组（C 组，12 例，K-L 4 级）。其中，A 组男 5 例，女 4 例；年龄 21～35 岁，平均 27.7 岁；B 组男 4 例，女 7 例；年龄 54～61 岁，平均 57.3 岁； C 组男 5 例，女 7 例；年龄 62～68 岁，平均 64.6 岁。术中取滑膜组织标本，无菌环境中 PBS 冲洗 3 次， 然后剪成 1 cm×1 cm 大小组织块，备用。
1.2 主要试剂及仪器
TRIzol 试剂盒（Invitrogen 公司，美国）；TaqMan 反转录试剂盒（Biosystems 公司，美国）；SYBR Green Ⅰ PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）；BCA 蛋白定量试剂盒、化学发光试剂显影免疫复合物 （Bio-Rad 公司，美国）。ABI 7300 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.3 观测指标
1.3.1 实时荧光定量 PCR 检测
取各组滑膜组织标本用 TRIzol 溶液提取总 RNA，然后按试剂盒说明书逆转录成 cDNA，将目的基因进行转录扩增，反应条件：94℃ 预变性 2 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，总共循环 50 次。PCR 引物序列见表 1。按照 2−ΔΔCt 值计算法，以 GAPDH 为内参，计算 Renin、ACE、AT1R 及 AT2R mRNA 相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3.2 Western blot 检测
取各组滑膜组织标本置于 RIPA 缓冲液中进行匀浆，4℃ 以离心半径 5 cm、13 000 r/min 离心 15 min，取上清；采用 BCA 蛋白试剂盒测定总蛋白浓度。使用 12%SDS-PAGE 分离总蛋白，并在 250 mA、2 h 条件下将蛋白转移到硝酸纤维素膜。室温下，将膜置于含 5% 脱脂牛奶的 TBST 封闭 1.5 h； 4℃ 下与 Renin（1∶1 000）、ACE（1∶1 000）、AT1R（1∶1 000）、AT2R（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育过夜；与相应的抗兔/抗鼠二抗孵育 1.5 h。将条带与化学发光试剂显影免疫复合物结合观察，采用 Image J 软件分析灰度值。以与 GAPDH 条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
B、C 组 Renin、ACE、AT1R mRNA 及蛋白相对表达量明显高于 A 组，C 组 ACE、AT1R mRNA 及蛋白相对表达量以及 Renin 蛋白相对表达量明显高于 B 组；B、C 组 AT2R mRNA 及蛋白相对表达量明显低于 A 组，C 组低于 B 组。上述指标组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1、2。
图1
实时荧光定量 PCR 检测 3 组滑膜组织中 Renin、ACE、 AT1R 和 AT2R mRNA 表达
Figure1.
The mRNA expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by qRT-PCR
图2
Western blot 检测 3 组滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 蛋白表达
a. 电泳图 1：A 组 2：B 组 3：C 组；b、c. 目的蛋白相对表达量
Figure2. The protein expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B3: Group C; b, c. Target protein relative expression
3 讨论
研究证实，骨关节炎病理改变主要为软骨细胞增生肥大、软骨基质分离降解和软骨下骨血管增生[15]。Kawakami 等[16]的研究对骨关节炎软骨细胞进行分离培养，经实时荧光定量 PCR 检测证实软骨细胞表达 RAS 中的血管紧张素受体，且在 IL-1 刺激下表达有增高趋势，说明 RAS 成分参与了骨关节炎病理过程中的炎症反应。Tsukamoto 等[17]报道骨关节炎软骨细胞增生肥大与 RAS 中的血管紧张素受体有关。上述研究结果提示软骨内局部 RAS 与骨关节炎的病理改变相关，其关键位点可能成为骨关节炎防治新靶点。
ACE 是 RAS 系统中的关键酶，可以催化 AngⅠ 转化为 AngⅡ，参与骨关节炎病理过程[18]。本研究实时荧光定量 PCR 以及 Western blot 检测结果显示，中、晚期骨关节炎滑膜组织中的 ACE 表达水平明显高于正常人群。既往研究报道骨关节炎患者滑膜组织中存在 ACE 且表达呈上调趋势，促进血管生成，造成骨关节炎的病理发展[18]。而 ACE 抑制剂能抑制 NF-κB 和炎症因子（如 TNF-α 和 IL-1β）能力，因此使用 ACE 抑制剂能够延缓骨关节炎的发展[18-19]。Martin 等[19]通过临床试验评估了 ACE 抑制剂卡托普利治疗类风湿性关节炎的效果。该研究包括 15 例活动性类风湿性关节炎患者，经随访 48 周，10 例患者类风湿性关节炎临床症状改善，包括关节疼痛缓解和关节肿胀减轻；24、48 周时炎症因子 C 反应蛋白水平也降低。上述研究结果说明，通过抑制 RAS 中 ACE 的关键靶点，可能是防治骨关节炎病理进展的新方法。
本研究还发现，中、晚期骨关节炎滑膜组织中 AT1R 表达水平明显高于正常人群。研究证实[20]，AngⅡ 对各种组织和器官的调控作用主要是通过 AT1R 和 AT2R 完成的，其中 AT1R 介导大多数 AngⅡ 功能，滑膜组织产生的 AngⅡ 通过作用于滑膜 AT1R，调节滑膜灌注和生长，影响关节炎发生、发展。本研究还发现随着 K-L 分级增加，滑膜组织中 AT1R 表达水平逐渐提高。Silveira 等[21]发现骨关节炎大鼠 AT1R 和 ACE 表达显著增强，但是使用氯沙坦干预后局部炎症反应降低，骨关节炎相关的组织学变化得到改善。同时，Silveira 等还观察到氯沙坦可减少中性粒细胞的募集，减少 TNF-α 和 IL-1β 的产生，并直接抑制白细胞-内皮细胞的相互作用。以上研究均表明抑制关节炎局部的 RAS 关键靶点，能够延缓骨关节炎的进展。
另外，随着骨关节炎 K-L 分级增加，膝关节滑膜组织中 AT1R 表达逐渐增加，但是 AT2R 表达逐渐降低，分析原因为在多种组织和器官中，AngⅡ 可通过 AT1R 发挥其类似细胞因子的作用[22-23]，随着骨关节炎严重程度增加，滑膜组织中 AT1R 水平提高，促进血管生成，造成软骨破坏；阻断 AT1R 后，增强的 Ang Ⅱ 水平可导致 AT2R 活性增加，而 AT2R 作用被认为与 AT1R 相反，因此增加 AT2R 表达能够潜在诱导抗炎机制激活，从而延缓关节炎进展。Tang 等[24]的研究显示，与假手术组相比，骨关节炎组大鼠胫骨近端 AT1R mRNA 和蛋白相对表达量增加，而 AT2R mRNA 和蛋白表达下降。此外，与单纯骨关节炎组相比，卡托普利治疗的骨关节炎组 AT2R 表达增加而 AT1R 表达减少。另外，Sagawa 等[25]报道，血管紧张素受体抑制剂奥美沙坦能抑制胶原酶诱导的骨关节炎的发展，研究发现奥美沙坦显著抑制了小鼠淋巴细胞增殖和 IFN-γ 的产生。因此，AT2R 激动剂具有作为治疗炎症和免疫疾病药物的潜力。
综上述，本研究发现随着骨关节炎加重，关节滑膜组织中 Renin、ACE、AT1R 表达量显著高于正常人群，AT2R 表达量呈下降趋势，说明滑膜组织中 RAS 系统相关组分与骨关节炎发展相关，为骨关节炎的早期预测以及干预提供了新思路。
作者贡献：吴元刚负责文章撰写及临床标本收集，李明阳和刘渊负责数据收集整理及统计分析，杨静负责临床标本收集，沈彬和曾羿负责科研设计、对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经四川大学华西医院医学伦理委员会批准（201302007）。患者均签署知情同意书。
