引用本文： 聂佳莹, 易阳艳, 朱元正. 人脂肪源细胞外囊泡联合脱细胞脂肪组织支架构建组织工程脂肪. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(2): 226-233. doi: 10.7507/1002-1892.201903064 复制
脂肪移植已广泛应用于美容整形外科和重建外科[1-2]，但存在移植后重吸收和成活率不高等缺陷[3-4]。因此，急需一种新的方式支持脂肪组织长期生长。近年来研究发现，使用生物材料搭载细胞或生长因子可促进脂肪组织在体内再生[5]。常见的生物材料有天然生物聚合物，如胶原蛋白、透明质酸等[6-7]，以及合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙醇酸等[8-9]。然而，由于这些材料存在吸附、细胞相容性差、脂肪组织生成过少、异物反应等问题，阻碍了在临床上的广泛应用[10]。
脂肪组织细胞外基质与 MSCs 具有密切的相互作用，并且能影响 MSCs 体内外增殖、迁移和谱系分化[11]。因此，将脂肪组织细胞外基质衍生的支架材料应用于脂肪组织工程，具有促进脂肪组织再生的作用[12-13]。脱细胞脂肪组织支架（decellularized adipose tissues，DAT）有效保留了原始脂肪组织的三维结构、力学性质和生物环境[14]，具有天然的脂肪诱导特性，能促进脂肪组织生成。基于以上优点，DAT 已在脂肪组织工程中得到了广泛研究，制备出多种类型的支架，如微载体[15]、水凝胶[10]和珠泡[16]等，并已在动物体内进行了实验。然而 DAT 在诱导成脂方面效果并非十分理想[15, 17]；同时，DAT 在体内的长期生长和稳定性仍有待研究[15]。
细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是 MSCs 和靶细胞间沟通的关键工具，通过将与母细胞相似的生物活性物质（如蛋白质、生物活性磷脂和 RNA）携带至靶细胞而发挥通讯功能[18]。Kelly 等[19]研究发现，脂肪组织可以在无 MSCs 情况下诱导脂肪组织生成，但具体诱导脂肪新生的成分和机制仍不清楚。Dai 等[20]研究发现人脂肪源 EV（human adipose tissue derived EV，hAT-EV）可以诱导脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）成脂分化，并促进主动脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成。因此，我们通过研究 hAT-EV 在体外对 ADSCs 成脂分化的影响，以及在小鼠体内诱导 DAT 脂肪生成的影响，探讨其能否达到改善 DAT 体内成脂不足的目的。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 周龄雌性 C57 小鼠 8 只，体质量（25±5）g，购自南昌大学实验动物中心。人体脂肪取自南昌大学第二附属医院整形外科行腹部负压吸脂术的健康女性患者，样本获取均经患者知情同意。
DMEM 培养基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美国）；Ⅰ 型胶原酶、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油红 O 染色剂、核酸酶（Sigma 公司，美国）；BCA 蛋白质定量试剂盒、兔抗人 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原、层粘连蛋白、CD63、凋亡诱导因子 6 相互作用蛋白抗体（apoptosis-inducible factor 6 interacting protein antibody，Alix）、肿瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、辣根过氧物化酶标记的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美国）。倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；CO2 培养箱、离心机（Thermo 公司，美国）；透射电镜（Zeiss 公司，德国）；纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight（Malvern 公司，英国）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；超高速离心机（Beckman 公司，美国）；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；0.22 μm 孔隙过滤膜（Millipore 公司，美国）。
1.2 hAT-EV 获取和鉴定
1.2.1 hAT-EV 获取
采用超高速离心法获取 hAT-EV[21]。具体方法：取 10 mL 新鲜脂肪组织，置于 30 mL 去除外泌体的完全培养基（含 1% 双抗、10%FBS 的 DMEM 培养基），于 37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 48 h；以 1 500×g 离心 5 min，收集上清培养液，再以 1 500×g 离心 10 min、3 000×g 离心 20 min、10 000×g 离心 30 min 去除细胞碎片；用 0.22 μm 孔隙过滤膜过滤去除大膜囊泡，4℃ 采用超速离心机以 100 000×g、离心 90 min；去除上层液体，用 1 mL PBS 液重悬，再次4℃ 以 100 000×g、 离心 60 min；去除上层液体，使用 100 μL PBS 液重悬。将获取的 hAT-EV 经 BCA 试剂盒检测蛋白浓度后，置于–80℃ 保存备用。
1.2.2 hAT-EV 鉴定
① 透射电镜观察 hAT-EV 形态：取 hAT-EV 10 μL 滴于透射电镜专用的载样铜网上，常温静置 2 min，滤纸吸去浮液，用 1%（W/V）磷钨酸溶液染色 5 min 后，滤纸吸去多余染色液，晾干，透射电镜观察 hAT-EV 形态。② hAT-EV 粒径分布分析：取浓度为 50 μg/mL 的 hAT-EV 100 μL 重悬于 1.5 mL PBS 内，经纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 进行检测。③ Western blot 检测 hAT-EV 的膜蛋白：取 hAT-EV 总蛋白质裂解液，使用 BCA 蛋白测定法估计蛋白浓度。采用 NuPage 电泳系统对蛋白提取物进行 SDS-PAGE 电泳，然后转移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分别加入兔抗人 CD63、TSG 101、Alix 一抗（1∶200）孵育过夜。然后加入二抗室温孵育 1 h，加入显影液，上机曝光。以脂肪组织作为对照，检测方法同上。
1.3 ADSCs 分离培养
按本课题组前期研究方案[22]分离 ADSCs并传代[15-16]。具体方法：无菌条件下采集吸脂术获得的游离脂肪组织 10 mL，PBS 冲洗 3 次去除血液、结缔组织后，加入等体积 0.2% Ⅰ 型胶原酶，置于 37℃ 恒温水浴箱消化，直至变为糊状。以 1 200×g 离心 5 min，弃上清，保留最下层沉淀。完全培养基重悬沉淀后接种于培养瓶内，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，48 h 后首次换液，之后每隔 24 h 换液，待细胞融合至 90% 后传代。
1.4 hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
1.4.1 hAT-EV 能否进入 ADSCs 观察
取浓度为 50 μg/mL hAT-EV 备用液 100 μL，重悬于 1 mL PBS 内，加入 4 μL PKH26 荧光染料溶液，37℃、5%CO2 孵育 20 min；将混合物于 4℃ 以 100 000×g 离心 70 min，弃上清液，并将 hAT-EV 轻轻重悬于 10 mL PBS 中；4℃、100 000×g 离心 70 min 去除多余染料，弃上清液，将 hAT-EV 重悬于 100 μL PBS 中备用。取第 2 代 ADSCs 重悬于无血清培养基中，置于 37℃、5%CO2 培养箱，待细胞贴壁后加入上述 PKH26 荧光标记的 hAT-EV，孵育 24 h 后采用 PBS 洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦荧光显微镜下观察 hAT-EV 是否进入细胞，镜下 PKH26 荧光标记的 hAT-EV 呈红色荧光。
1.4.2 hAT-EV 诱导 ADSCs 成脂分化作用评价
取第 3 代 ADSCs，以 5×105个/孔浓度接种至 6 孔板。实验分为 3 组，分别为阴性对照组、阳性对照组和实验组。阴性对照组采用单纯完全培养基培养；阳性对照组采用成脂诱导培养基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IMBX、10 μmol/L 胰岛素、200 μmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培养基）培养；实验组采用添加 50 μg/mL hAT-EV 的完全培养基培养。每隔 3 d 换液，第 15 天行油红 O 染色观察。每张切片随机选取 5 个油红 O 染色表达区域的视野，通过 Image J 软件计算油红 O 染色阳性脂滴的密度。
1.5 DAT 制备及表征
1.5.1 DAT 制备
取吸脂术获取的游离脂肪组织 100 mL，以 1 000×g 离心 5 min 后保留下层脂肪组织，弃中层液体和上层油脂；使用匀浆机将脂肪组织与等体积 PBS 以 12 000 r/min 匀浆 10 min；将匀浆后的样品在 37～−80℃ 反复冻融 3 次，每次冻融时间约 1 h；将冻融后的脂肪组织以 3 000×g离心 10 min，弃上层油脂和液体并收集白色沉淀。按 Flynn 等[14]无洗涤剂方案对白色沉淀物进行脱细胞处理，具体方法：将白色沉淀物孵化于 0.05% 胰蛋白酶中，放入 37℃ 恒温水浴锅消化 16 h 并不断搅拌；然后将白色沉淀物在 99.9% 异丙醇溶液中萃取 18 h 去除脂质；然后使用核酸酶（包括 500 U/mL DNase TypeⅠ和 1 mg/mL RNase）孵化过夜处理；用 99.9% 异丙醇溶液萃取 6 h，弃剩余脂质；最后用 70% 乙醇消毒 4 h。以上每个步骤结束后样品均使用 PBS 液至少清洗 3 遍。将获得的 DAT 样品一部分进行表征检测，剩余 DAT 样品冷冻干燥储存备用。
1.5.2 组织学观察
DAT 样品用 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋，5 μm 厚切片，常规行 HE 染色和 Masson 染色观察。
1.5.3 扫描电镜观察
DAT 样品于 2.5% 戊二醛溶液固定 4 h，梯度乙醇脱水处理后临界点干燥，涂覆金，扫描电镜下观察 DAT 微观结构。
1.5.4 免疫组织化学染色观察
DAT 样品经石蜡包埋、10 μm 厚切片后，脱石蜡并用甲醇和丙酮固定；室温下用 2% 牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100 和 1×PBS 溶液封闭 45 min；加入兔抗人 Ⅰ 型胶原（1∶200）、Ⅳ 型胶原（1∶200）、层粘连蛋白一抗（1∶200），4℃ 潮湿环境孵育过夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔荧光二抗 IgG，4℃ 潮湿环境孵育 1 h；PBS 冲洗切片，DAPI 封固剂固定，共聚焦荧光显微镜观察。
1.5.5 Western blot 检测
取 DAT 总蛋白质裂解液，使用 BCA 蛋白测定法估计蛋白浓度；采用 NuPage 电泳系统对蛋白提取物进行 SDS-PAGE 电泳，然后转移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分别加入兔抗人 Ⅰ 型胶原（1∶200）、Ⅳ 型胶原（1∶200）、层粘连蛋白一抗（1∶200），再加入二抗室温孵育 1 h，加入显影液，上机曝光。通过 Image J 软件半定量分析各蛋白相对灰度值。
1.6 hAT-EV 对 DAT 体内成脂的影响
1.6.1 实验分组及方法
无菌条件下将 DAT 剪碎至小米粒大小。取 C57 小鼠 8 只，以 1.5% 戊巴比妥腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，使用 18 号针分别将 DAT 点状注射至小鼠双侧背部皮下，每侧注射 0.3 mL。左侧为实验组，每周注射 0.2 mL、50 μg/mL hAT-EV 至 DAT 内；右侧为对照组，每周注射等量 PBS 液。
1.6.2 大体观察及湿重检测
于 12 周处死小鼠，从周围组织中分离 DAT，大体观察外观；使用电子天平称量 DAT 新生物湿重。
1.6.3 组织学及免疫组织化学染色
取 DAT 样本，4% 多聚甲醛固定后冰冻切片，片厚 10 μm，常规行 HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色[20]，共聚焦荧光显微镜观察新生组织中细胞和纤维分布。随机选取 5 个高倍镜（×400）视野，采用 Image J 软件计算围脂滴蛋白荧光面积，用以表示新生物中脂肪组织比例，从而评估 hAT-EV 在体内诱导脂肪新生的能力。
1.7 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 hAT-EV 的鉴定
透射电镜观察示，hAT-EV 呈双层包膜的球形。纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 检测结果显示，97.9% 的 hAT-EV 粒径为 32.67～220.20 nm，峰值为 91.28 nm。Western blot 检测示 hAT-EV 高表达 CD63、TSG101 和 Alix，不表达细胞骨架蛋白 β-actin；而脂肪组织高表达 β-actin，低表达 CD63、TSG101 和 Alix。见图 1。
图1
hAT-EV 鉴定
a. 透射电镜观察（×25 k）；b. 纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 检测；c. Western blot 检测 1：hAT-EV 2：脂肪组织
Figure1. Identification of hAT-EVa. Transmission electron microscope observation (×25 k); b. Nanoparticles tracking analyzer NanoSight detection; c. Western blot detection 1：hAT-EV 2: Adipose tissue
2.2 hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
2.2.1 hAT-EV 能否进入 ADSCs 观察
共聚焦荧光显微镜观察示，PKH26 标记的 hAT-EV 被 ADSCs 摄取并分布于细胞核周围，表明 hAT-EV 可进入 ADSCs。见图 2a。
图2
hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
a. 共聚焦荧光显微镜观察（×400）；b. 油红 O 染色观察（×400） 从左至右依次为阴性对照组、阳性对照组和实验组
Figure2. Observation on co-culture of hAT-EV and ADSCsa. Confocal fluorescence microscope observation (×400); b. Oil red O staining observation (×400) From left to right for negative control group, positive control group, and experimental group, respectively
2.2.2 hAT-EV 诱导 ADSCs 成脂分化作用评价
油红 O 染色示，阴性对照组、阳性对照组、实验组油红 O 染色阳性脂滴的密度分别为 0.05±0.01、0.18±0.02、0.12±0.03，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2b。
2.3 DAT 表征
① 大体观察：脂肪组织经脱细胞处理后由黄色变成白色。② 组织学观察：HE 染色示，经脱细胞处理后，DAT 中无细胞和细胞碎片；Masson 染色示 DAT 主要成分为胶原蛋白。③ 扫描电镜观察：脂肪组织经脱细胞处理后，细胞外基质中未发现细胞和细胞碎片存在，同时可见粗大胶原纤维束。④ 免疫组织化学染色观察：DAT 中可见 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原和层粘连蛋白阳性表达。⑤ Western blot 检测：DAT 中 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原和层粘连蛋白呈阳性表达，相对灰度值分别为 1.12±0.08、1.04±0.02、0.89±0.04。见图 3。
图3
DAT 表征
a. 大体观察；b. HE 染色观察（×400）；c. Masson 染色观察（×400）；d. 扫描电镜观察（×2 000）；e. Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色观察（×400）；f. Ⅳ 型胶原免疫组织化学染色观察（×400）；g. 层粘连蛋白免疫组织化学染色观察（×400）；h. Western blot 检测
Figure3. Characterization of DATa. General observation; b. HE staining observation (×400); c. Masson staining observation (×400); d. SEM observation (×2 000); e. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ (×400); f. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅳ（×400); g. Immunohistochemical staining of laminin (×400); h. Western blot detection
2.4 hAT-EV 对 DAT 体内成脂的影响
① 大体观察两组均可见黄色 DAT 样本，实验组 DAT 新生物湿重为（0.76±0.21）g，显著高于对照组的（0.52±0.15）g，差异有统计学意义（t=2.278，P=0.048）。② HE 染色示，实验组圆形脂滴结构比对照组多，对照组胶原含量高于实验组；两组均无明显炎性细胞浸润和坏死。③ 围脂滴蛋白免疫荧光染色示，对照组新生脂肪组织仅生长在 DAT 外周，而实验组新生脂肪组织生长在 DAT 外周和内部。高倍镜下实验组 DAT 新生物中脂肪组织比例为 13.02%±5.24%，高于对照组的 8.12%±4.38%，差异有统计学意义（t=4.648，P=0.017）。见图 4。
图4
hAT-EV 联合 DAT 在 C57 小鼠皮下构建组织工程脂肪观测
从左至右分别为实验组、对照组 a. 大体观察（箭头示 DAT）；b. HE 染色观察（×400）；c. 围脂滴蛋白免疫荧光染色观察（共聚焦荧光显微镜×50）；d. 围脂滴蛋白免疫荧光染色观察（共聚焦荧光显微镜×400）
Figure4. Observation on the subcutaneous construction of tissue engineered fat in C57 mice with hAT-EV and DATFrom left to right for experimental group and control group，respectively a. General observation (Arrow indicated DAT); b. HE staining observation (×400); c. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×50); d. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×400)
3 讨论
DAT 是近年发展起来的一种新型支架材料，在脂肪组织工程中具有广阔应用前景。与合成或天然生物聚合物支架相比，DAT 的主要优势是具备天然的脂肪诱导特性——可以诱导 MSCs 成脂分化[14-15]；此外，由于脂肪组织具有来源丰富、获取简便的优点，使得 DAT 的原材料比其他组织细胞外基质的原材料更易获取[23]；最后，应用自体 DAT 还可以避免动物源性支架，如牛或猪胶原蛋白潜在的免疫反应和异种疾病传播风险[24]。尽管 DAT 有诸多优点，但既往研究表明，将 DAT 或 DAT 搭载 ADSCs 植入小鼠体内，未诱导生成足够的脂肪组织[15]。引起脂肪组织生成不足的原因可能是体内血管组织缺乏或诱导脂肪组织新生的生长因子不足[25]。同时，在体内 DAT 和新生脂肪组织的长期稳定性仍有待明确。
因此，在本研究中我们采用了一种新方案诱导脂肪组织生成——DAT 搭载 hAT-EV。DAT 组织学观察显示，经过脱细胞处理后脂肪组织达到了彻底脱细胞和保留天然细胞外基质的目的。其中，细胞外基质蛋白对于维持脂肪细胞的结构完整至关重要，同时对脂肪组织的发育和生长也发挥重要作用[26-27]。异丙醇作为脂肪组织脱细胞常用有机溶剂，可以有效去除油脂，但同时也会导致细胞外基质蛋白沉淀，从而破坏细胞外基质蛋白成分[28-30]。本实验脱细胞前先使用匀浆机处理脂肪组织 30 min，再放入−80℃ 冰箱过夜，可以最大程度去除脂肪组织油脂，减少异丙醇处理时间，同时也能减少 DAT 中毒性化学物质残留。扫描电镜和 Masson 染色显示，DAT 中网状胶原保存良好；免疫组织化学染色和 Western blot 结果显示，DAT 中含有丰富 Ⅰ、Ⅳ 型胶原蛋白和层粘连蛋白。这些蛋白是脂肪组织基底膜的主要成分，胶原蛋白网可为脂肪组织中细胞提供结构支持[31]，而层粘连蛋白可影响细胞活动，如细胞黏附、迁移和分化[32-34]。以上结果表明我们成功制备 DAT。
Dai 等[20]研究发现，脂肪组织上清液可以诱导 ADSCs 成脂分化，并促进主动脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成，从而促进脂肪组织生成。Kato 等[28]也发现从脂肪组织提取的 EV 可诱导脂肪生成。本研究中，我们采用超高速离心法从脂肪组织上清液中获取 hAT-EV。在体外实验中，将 PKH26 荧光标记的 hAT-EV 与 ADSCs 共培养后发现， hAT-EV 可以被 ADSCs 摄取并促进 ADSCs 成脂分化；在体内实验中，通过对比 DAT 新生物湿重、HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色结果发现，hAT-EV 具有成脂诱导功能，在体内联合 DAT 可构建脂肪细胞密度更高的组织工程脂肪。研究表明，移植物的脂肪生成和体积在 12 周后趋于稳定[28]，并且在之后的 1 年内移植物体积仅有轻微减少[12]。因此，我们选定 12 周取材来评估新生物的成脂效果。12 周时，通过 HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色分析表明，DAT 搭载 hAT-EV 构建的组织工程脂肪中脂肪细胞密度更高；并且与其他 DAT 诱导脂肪再生的研究[15-16]相比，hAT-EV 显著提高了 DAT 新生物湿重。值得注意的是，对比围脂滴蛋白免疫荧光染色我们发现，经 hAT-EV 作用后 DAT 新生物中心可见脂肪组织，而对照组仅在 DAT 新生物外周有脂肪组织生长。因此，我们推测 hAT-EV 可能具有驱化脂肪前体细胞的能力，这一结论我们将在后续研究中进一步论证。此外，限制组织工程脂肪应用的主要原因除了脂肪再生困难外，如何促进新生物在移植早期快速再血管化也是当前研究瓶颈。血管再生是脂肪再生的前提条件[35-36]，因此发现一种既可以促进血管新生又可以诱导脂肪再生的物质十分重要。本研究仅观察了 hAT-EV 的成脂效果，我们将在后续研究中进一步探讨 hAT-EV 成血管作用。
综上述，通过本研究我们发现 hAT-EV 在体内、外均可促进脂肪新生，DAT 搭载 hAT-EV 可作为一种诱导脂肪组织新生的新方法，在软组织缺损修复领域具有潜在应用前景。
作者贡献：聂佳莹参与实验设计及实施，数据收集整理及统计分析，文章起草；易阳艳参与实验设计、对文章的知识性内容作批评性审阅；朱元正参与实验设计及实施，数据收集整理及统计分析，对文章的知识性内容作批评性审阅
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经南昌大学第二附属医院医学伦理委员会批准［2018 第（025）号］。所有动物实验均经南昌大学第二附属医院实验动物伦理委员会批准，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（赣）2015-0001。
脂肪移植已广泛应用于美容整形外科和重建外科[1-2]，但存在移植后重吸收和成活率不高等缺陷[3-4]。因此，急需一种新的方式支持脂肪组织长期生长。近年来研究发现，使用生物材料搭载细胞或生长因子可促进脂肪组织在体内再生[5]。常见的生物材料有天然生物聚合物，如胶原蛋白、透明质酸等[6-7]，以及合成聚合物，如聚乙二醇、聚乙醇酸等[8-9]。然而，由于这些材料存在吸附、细胞相容性差、脂肪组织生成过少、异物反应等问题，阻碍了在临床上的广泛应用[10]。
脂肪组织细胞外基质与 MSCs 具有密切的相互作用，并且能影响 MSCs 体内外增殖、迁移和谱系分化[11]。因此，将脂肪组织细胞外基质衍生的支架材料应用于脂肪组织工程，具有促进脂肪组织再生的作用[12-13]。脱细胞脂肪组织支架（decellularized adipose tissues，DAT）有效保留了原始脂肪组织的三维结构、力学性质和生物环境[14]，具有天然的脂肪诱导特性，能促进脂肪组织生成。基于以上优点，DAT 已在脂肪组织工程中得到了广泛研究，制备出多种类型的支架，如微载体[15]、水凝胶[10]和珠泡[16]等，并已在动物体内进行了实验。然而 DAT 在诱导成脂方面效果并非十分理想[15, 17]；同时，DAT 在体内的长期生长和稳定性仍有待研究[15]。
细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是 MSCs 和靶细胞间沟通的关键工具，通过将与母细胞相似的生物活性物质（如蛋白质、生物活性磷脂和 RNA）携带至靶细胞而发挥通讯功能[18]。Kelly 等[19]研究发现，脂肪组织可以在无 MSCs 情况下诱导脂肪组织生成，但具体诱导脂肪新生的成分和机制仍不清楚。Dai 等[20]研究发现人脂肪源 EV（human adipose tissue derived EV，hAT-EV）可以诱导脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）成脂分化，并促进主动脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成。因此，我们通过研究 hAT-EV 在体外对 ADSCs 成脂分化的影响，以及在小鼠体内诱导 DAT 脂肪生成的影响，探讨其能否达到改善 DAT 体内成脂不足的目的。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 周龄雌性 C57 小鼠 8 只，体质量（25±5）g，购自南昌大学实验动物中心。人体脂肪取自南昌大学第二附属医院整形外科行腹部负压吸脂术的健康女性患者，样本获取均经患者知情同意。
DMEM 培养基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美国）；Ⅰ 型胶原酶、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油红 O 染色剂、核酸酶（Sigma 公司，美国）；BCA 蛋白质定量试剂盒、兔抗人 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原、层粘连蛋白、CD63、凋亡诱导因子 6 相互作用蛋白抗体（apoptosis-inducible factor 6 interacting protein antibody，Alix）、肿瘤易感基因 101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）、辣根过氧物化酶标记的山羊抗兔 IgG（Abcam 公司，美国）。倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；CO2 培养箱、离心机（Thermo 公司，美国）；透射电镜（Zeiss 公司，德国）；纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight（Malvern 公司，英国）；共聚焦荧光显微镜（Leica 公司，德国）；超高速离心机（Beckman 公司，美国）；扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；0.22 μm 孔隙过滤膜（Millipore 公司，美国）。
1.2 hAT-EV 获取和鉴定
1.2.1 hAT-EV 获取
采用超高速离心法获取 hAT-EV[21]。具体方法：取 10 mL 新鲜脂肪组织，置于 30 mL 去除外泌体的完全培养基（含 1% 双抗、10%FBS 的 DMEM 培养基），于 37℃、5%CO2 细胞培养箱孵育 48 h；以 1 500×g 离心 5 min，收集上清培养液，再以 1 500×g 离心 10 min、3 000×g 离心 20 min、10 000×g 离心 30 min 去除细胞碎片；用 0.22 μm 孔隙过滤膜过滤去除大膜囊泡，4℃ 采用超速离心机以 100 000×g、离心 90 min；去除上层液体，用 1 mL PBS 液重悬，再次4℃ 以 100 000×g、 离心 60 min；去除上层液体，使用 100 μL PBS 液重悬。将获取的 hAT-EV 经 BCA 试剂盒检测蛋白浓度后，置于–80℃ 保存备用。
1.2.2 hAT-EV 鉴定
① 透射电镜观察 hAT-EV 形态：取 hAT-EV 10 μL 滴于透射电镜专用的载样铜网上，常温静置 2 min，滤纸吸去浮液，用 1%（W/V）磷钨酸溶液染色 5 min 后，滤纸吸去多余染色液，晾干，透射电镜观察 hAT-EV 形态。② hAT-EV 粒径分布分析：取浓度为 50 μg/mL 的 hAT-EV 100 μL 重悬于 1.5 mL PBS 内，经纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 进行检测。③ Western blot 检测 hAT-EV 的膜蛋白：取 hAT-EV 总蛋白质裂解液，使用 BCA 蛋白测定法估计蛋白浓度。采用 NuPage 电泳系统对蛋白提取物进行 SDS-PAGE 电泳，然后转移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分别加入兔抗人 CD63、TSG 101、Alix 一抗（1∶200）孵育过夜。然后加入二抗室温孵育 1 h，加入显影液，上机曝光。以脂肪组织作为对照，检测方法同上。
1.3 ADSCs 分离培养
按本课题组前期研究方案[22]分离 ADSCs并传代[15-16]。具体方法：无菌条件下采集吸脂术获得的游离脂肪组织 10 mL，PBS 冲洗 3 次去除血液、结缔组织后，加入等体积 0.2% Ⅰ 型胶原酶，置于 37℃ 恒温水浴箱消化，直至变为糊状。以 1 200×g 离心 5 min，弃上清，保留最下层沉淀。完全培养基重悬沉淀后接种于培养瓶内，置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，48 h 后首次换液，之后每隔 24 h 换液，待细胞融合至 90% 后传代。
1.4 hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
1.4.1 hAT-EV 能否进入 ADSCs 观察
取浓度为 50 μg/mL hAT-EV 备用液 100 μL，重悬于 1 mL PBS 内，加入 4 μL PKH26 荧光染料溶液，37℃、5%CO2 孵育 20 min；将混合物于 4℃ 以 100 000×g 离心 70 min，弃上清液，并将 hAT-EV 轻轻重悬于 10 mL PBS 中；4℃、100 000×g 离心 70 min 去除多余染料，弃上清液，将 hAT-EV 重悬于 100 μL PBS 中备用。取第 2 代 ADSCs 重悬于无血清培养基中，置于 37℃、5%CO2 培养箱，待细胞贴壁后加入上述 PKH26 荧光标记的 hAT-EV，孵育 24 h 后采用 PBS 洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定、DAPI 染色。共聚焦荧光显微镜下观察 hAT-EV 是否进入细胞，镜下 PKH26 荧光标记的 hAT-EV 呈红色荧光。
1.4.2 hAT-EV 诱导 ADSCs 成脂分化作用评价
取第 3 代 ADSCs，以 5×105个/孔浓度接种至 6 孔板。实验分为 3 组，分别为阴性对照组、阳性对照组和实验组。阴性对照组采用单纯完全培养基培养；阳性对照组采用成脂诱导培养基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L IMBX、10 μmol/L 胰岛素、200 μmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培养基）培养；实验组采用添加 50 μg/mL hAT-EV 的完全培养基培养。每隔 3 d 换液，第 15 天行油红 O 染色观察。每张切片随机选取 5 个油红 O 染色表达区域的视野，通过 Image J 软件计算油红 O 染色阳性脂滴的密度。
1.5 DAT 制备及表征
1.5.1 DAT 制备
取吸脂术获取的游离脂肪组织 100 mL，以 1 000×g 离心 5 min 后保留下层脂肪组织，弃中层液体和上层油脂；使用匀浆机将脂肪组织与等体积 PBS 以 12 000 r/min 匀浆 10 min；将匀浆后的样品在 37～−80℃ 反复冻融 3 次，每次冻融时间约 1 h；将冻融后的脂肪组织以 3 000×g离心 10 min，弃上层油脂和液体并收集白色沉淀。按 Flynn 等[14]无洗涤剂方案对白色沉淀物进行脱细胞处理，具体方法：将白色沉淀物孵化于 0.05% 胰蛋白酶中，放入 37℃ 恒温水浴锅消化 16 h 并不断搅拌；然后将白色沉淀物在 99.9% 异丙醇溶液中萃取 18 h 去除脂质；然后使用核酸酶（包括 500 U/mL DNase TypeⅠ和 1 mg/mL RNase）孵化过夜处理；用 99.9% 异丙醇溶液萃取 6 h，弃剩余脂质；最后用 70% 乙醇消毒 4 h。以上每个步骤结束后样品均使用 PBS 液至少清洗 3 遍。将获得的 DAT 样品一部分进行表征检测，剩余 DAT 样品冷冻干燥储存备用。
1.5.2 组织学观察
DAT 样品用 4% 多聚甲醛固定、石蜡包埋，5 μm 厚切片，常规行 HE 染色和 Masson 染色观察。
1.5.3 扫描电镜观察
DAT 样品于 2.5% 戊二醛溶液固定 4 h，梯度乙醇脱水处理后临界点干燥，涂覆金，扫描电镜下观察 DAT 微观结构。
1.5.4 免疫组织化学染色观察
DAT 样品经石蜡包埋、10 μm 厚切片后，脱石蜡并用甲醇和丙酮固定；室温下用 2% 牛血清白蛋白、0.1%Triton X-100 和 1×PBS 溶液封闭 45 min；加入兔抗人 Ⅰ 型胶原（1∶200）、Ⅳ 型胶原（1∶200）、层粘连蛋白一抗（1∶200），4℃ 潮湿环境孵育过夜；PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔荧光二抗 IgG，4℃ 潮湿环境孵育 1 h；PBS 冲洗切片，DAPI 封固剂固定，共聚焦荧光显微镜观察。
1.5.5 Western blot 检测
取 DAT 总蛋白质裂解液，使用 BCA 蛋白测定法估计蛋白浓度；采用 NuPage 电泳系统对蛋白提取物进行 SDS-PAGE 电泳，然后转移固定至聚偏二氟乙烯膜上；分别加入兔抗人 Ⅰ 型胶原（1∶200）、Ⅳ 型胶原（1∶200）、层粘连蛋白一抗（1∶200），再加入二抗室温孵育 1 h，加入显影液，上机曝光。通过 Image J 软件半定量分析各蛋白相对灰度值。
1.6 hAT-EV 对 DAT 体内成脂的影响
1.6.1 实验分组及方法
无菌条件下将 DAT 剪碎至小米粒大小。取 C57 小鼠 8 只，以 1.5% 戊巴比妥腹腔注射（40 mg/kg）麻醉，使用 18 号针分别将 DAT 点状注射至小鼠双侧背部皮下，每侧注射 0.3 mL。左侧为实验组，每周注射 0.2 mL、50 μg/mL hAT-EV 至 DAT 内；右侧为对照组，每周注射等量 PBS 液。
1.6.2 大体观察及湿重检测
于 12 周处死小鼠，从周围组织中分离 DAT，大体观察外观；使用电子天平称量 DAT 新生物湿重。
1.6.3 组织学及免疫组织化学染色
取 DAT 样本，4% 多聚甲醛固定后冰冻切片，片厚 10 μm，常规行 HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色[20]，共聚焦荧光显微镜观察新生组织中细胞和纤维分布。随机选取 5 个高倍镜（×400）视野，采用 Image J 软件计算围脂滴蛋白荧光面积，用以表示新生物中脂肪组织比例，从而评估 hAT-EV 在体内诱导脂肪新生的能力。
1.7 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用配对 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 hAT-EV 的鉴定
透射电镜观察示，hAT-EV 呈双层包膜的球形。纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 检测结果显示，97.9% 的 hAT-EV 粒径为 32.67～220.20 nm，峰值为 91.28 nm。Western blot 检测示 hAT-EV 高表达 CD63、TSG101 和 Alix，不表达细胞骨架蛋白 β-actin；而脂肪组织高表达 β-actin，低表达 CD63、TSG101 和 Alix。见图 1。
图1
hAT-EV 鉴定
a. 透射电镜观察（×25 k）；b. 纳米颗粒跟踪分析仪 NanoSight 检测；c. Western blot 检测 1：hAT-EV 2：脂肪组织
Figure1. Identification of hAT-EVa. Transmission electron microscope observation (×25 k); b. Nanoparticles tracking analyzer NanoSight detection; c. Western blot detection 1：hAT-EV 2: Adipose tissue
2.2 hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
2.2.1 hAT-EV 能否进入 ADSCs 观察
共聚焦荧光显微镜观察示，PKH26 标记的 hAT-EV 被 ADSCs 摄取并分布于细胞核周围，表明 hAT-EV 可进入 ADSCs。见图 2a。
图2
hAT-EV 与 ADSCs 共培养观察
a. 共聚焦荧光显微镜观察（×400）；b. 油红 O 染色观察（×400） 从左至右依次为阴性对照组、阳性对照组和实验组
Figure2. Observation on co-culture of hAT-EV and ADSCsa. Confocal fluorescence microscope observation (×400); b. Oil red O staining observation (×400) From left to right for negative control group, positive control group, and experimental group, respectively
2.2.2 hAT-EV 诱导 ADSCs 成脂分化作用评价
油红 O 染色示，阴性对照组、阳性对照组、实验组油红 O 染色阳性脂滴的密度分别为 0.05±0.01、0.18±0.02、0.12±0.03，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2b。
2.3 DAT 表征
① 大体观察：脂肪组织经脱细胞处理后由黄色变成白色。② 组织学观察：HE 染色示，经脱细胞处理后，DAT 中无细胞和细胞碎片；Masson 染色示 DAT 主要成分为胶原蛋白。③ 扫描电镜观察：脂肪组织经脱细胞处理后，细胞外基质中未发现细胞和细胞碎片存在，同时可见粗大胶原纤维束。④ 免疫组织化学染色观察：DAT 中可见 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原和层粘连蛋白阳性表达。⑤ Western blot 检测：DAT 中 Ⅰ 型胶原、Ⅳ 型胶原和层粘连蛋白呈阳性表达，相对灰度值分别为 1.12±0.08、1.04±0.02、0.89±0.04。见图 3。
图3
DAT 表征
a. 大体观察；b. HE 染色观察（×400）；c. Masson 染色观察（×400）；d. 扫描电镜观察（×2 000）；e. Ⅰ 型胶原免疫组织化学染色观察（×400）；f. Ⅳ 型胶原免疫组织化学染色观察（×400）；g. 层粘连蛋白免疫组织化学染色观察（×400）；h. Western blot 检测
Figure3. Characterization of DATa. General observation; b. HE staining observation (×400); c. Masson staining observation (×400); d. SEM observation (×2 000); e. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ (×400); f. Immunohistochemical staining of collagen type Ⅳ（×400); g. Immunohistochemical staining of laminin (×400); h. Western blot detection
2.4 hAT-EV 对 DAT 体内成脂的影响
① 大体观察两组均可见黄色 DAT 样本，实验组 DAT 新生物湿重为（0.76±0.21）g，显著高于对照组的（0.52±0.15）g，差异有统计学意义（t=2.278，P=0.048）。② HE 染色示，实验组圆形脂滴结构比对照组多，对照组胶原含量高于实验组；两组均无明显炎性细胞浸润和坏死。③ 围脂滴蛋白免疫荧光染色示，对照组新生脂肪组织仅生长在 DAT 外周，而实验组新生脂肪组织生长在 DAT 外周和内部。高倍镜下实验组 DAT 新生物中脂肪组织比例为 13.02%±5.24%，高于对照组的 8.12%±4.38%，差异有统计学意义（t=4.648，P=0.017）。见图 4。
图4
hAT-EV 联合 DAT 在 C57 小鼠皮下构建组织工程脂肪观测
从左至右分别为实验组、对照组 a. 大体观察（箭头示 DAT）；b. HE 染色观察（×400）；c. 围脂滴蛋白免疫荧光染色观察（共聚焦荧光显微镜×50）；d. 围脂滴蛋白免疫荧光染色观察（共聚焦荧光显微镜×400）
Figure4. Observation on the subcutaneous construction of tissue engineered fat in C57 mice with hAT-EV and DATFrom left to right for experimental group and control group，respectively a. General observation (Arrow indicated DAT); b. HE staining observation (×400); c. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×50); d. Immunofluorescence staining of peri-lipoprotein (Confocal fluorescence microscope×400)
3 讨论
DAT 是近年发展起来的一种新型支架材料，在脂肪组织工程中具有广阔应用前景。与合成或天然生物聚合物支架相比，DAT 的主要优势是具备天然的脂肪诱导特性——可以诱导 MSCs 成脂分化[14-15]；此外，由于脂肪组织具有来源丰富、获取简便的优点，使得 DAT 的原材料比其他组织细胞外基质的原材料更易获取[23]；最后，应用自体 DAT 还可以避免动物源性支架，如牛或猪胶原蛋白潜在的免疫反应和异种疾病传播风险[24]。尽管 DAT 有诸多优点，但既往研究表明，将 DAT 或 DAT 搭载 ADSCs 植入小鼠体内，未诱导生成足够的脂肪组织[15]。引起脂肪组织生成不足的原因可能是体内血管组织缺乏或诱导脂肪组织新生的生长因子不足[25]。同时，在体内 DAT 和新生脂肪组织的长期稳定性仍有待明确。
因此，在本研究中我们采用了一种新方案诱导脂肪组织生成——DAT 搭载 hAT-EV。DAT 组织学观察显示，经过脱细胞处理后脂肪组织达到了彻底脱细胞和保留天然细胞外基质的目的。其中，细胞外基质蛋白对于维持脂肪细胞的结构完整至关重要，同时对脂肪组织的发育和生长也发挥重要作用[26-27]。异丙醇作为脂肪组织脱细胞常用有机溶剂，可以有效去除油脂，但同时也会导致细胞外基质蛋白沉淀，从而破坏细胞外基质蛋白成分[28-30]。本实验脱细胞前先使用匀浆机处理脂肪组织 30 min，再放入−80℃ 冰箱过夜，可以最大程度去除脂肪组织油脂，减少异丙醇处理时间，同时也能减少 DAT 中毒性化学物质残留。扫描电镜和 Masson 染色显示，DAT 中网状胶原保存良好；免疫组织化学染色和 Western blot 结果显示，DAT 中含有丰富 Ⅰ、Ⅳ 型胶原蛋白和层粘连蛋白。这些蛋白是脂肪组织基底膜的主要成分，胶原蛋白网可为脂肪组织中细胞提供结构支持[31]，而层粘连蛋白可影响细胞活动，如细胞黏附、迁移和分化[32-34]。以上结果表明我们成功制备 DAT。
Dai 等[20]研究发现，脂肪组织上清液可以诱导 ADSCs 成脂分化，并促进主动脉内皮细胞增殖、迁移和血管生成，从而促进脂肪组织生成。Kato 等[28]也发现从脂肪组织提取的 EV 可诱导脂肪生成。本研究中，我们采用超高速离心法从脂肪组织上清液中获取 hAT-EV。在体外实验中，将 PKH26 荧光标记的 hAT-EV 与 ADSCs 共培养后发现， hAT-EV 可以被 ADSCs 摄取并促进 ADSCs 成脂分化；在体内实验中，通过对比 DAT 新生物湿重、HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色结果发现，hAT-EV 具有成脂诱导功能，在体内联合 DAT 可构建脂肪细胞密度更高的组织工程脂肪。研究表明，移植物的脂肪生成和体积在 12 周后趋于稳定[28]，并且在之后的 1 年内移植物体积仅有轻微减少[12]。因此，我们选定 12 周取材来评估新生物的成脂效果。12 周时，通过 HE 染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色分析表明，DAT 搭载 hAT-EV 构建的组织工程脂肪中脂肪细胞密度更高；并且与其他 DAT 诱导脂肪再生的研究[15-16]相比，hAT-EV 显著提高了 DAT 新生物湿重。值得注意的是，对比围脂滴蛋白免疫荧光染色我们发现，经 hAT-EV 作用后 DAT 新生物中心可见脂肪组织，而对照组仅在 DAT 新生物外周有脂肪组织生长。因此，我们推测 hAT-EV 可能具有驱化脂肪前体细胞的能力，这一结论我们将在后续研究中进一步论证。此外，限制组织工程脂肪应用的主要原因除了脂肪再生困难外，如何促进新生物在移植早期快速再血管化也是当前研究瓶颈。血管再生是脂肪再生的前提条件[35-36]，因此发现一种既可以促进血管新生又可以诱导脂肪再生的物质十分重要。本研究仅观察了 hAT-EV 的成脂效果，我们将在后续研究中进一步探讨 hAT-EV 成血管作用。
综上述，通过本研究我们发现 hAT-EV 在体内、外均可促进脂肪新生，DAT 搭载 hAT-EV 可作为一种诱导脂肪组织新生的新方法，在软组织缺损修复领域具有潜在应用前景。
作者贡献：聂佳莹参与实验设计及实施，数据收集整理及统计分析，文章起草；易阳艳参与实验设计、对文章的知识性内容作批评性审阅；朱元正参与实验设计及实施，数据收集整理及统计分析，对文章的知识性内容作批评性审阅
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经南昌大学第二附属医院医学伦理委员会批准［2018 第（025）号］。所有动物实验均经南昌大学第二附属医院实验动物伦理委员会批准，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，实验动物使用许可证号：SYXK（赣）2015-0001。
