引用本文： 柴乐, 全仁夫, 胡劲涛, 黄小龙, 吕建兰, 张灿, 邱锐, 蔡兵兵. BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合羟基磷灰石/二氧化锆泡沫陶瓷与诱导多能干细胞来源 MSCs 的体外研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(2): 252-258. doi: 10.7507/1002-1892.201809060 复制
大段骨缺损修复一直是骨科临床难题之一。组织工程骨理念的提出，为骨缺损修复提供了新思路和新途径。组织工程骨是由种子细胞、支架、生物活性物质等组成，通过这些物质的相互调控，可促进骨组织愈合。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/二氧化锆（ZrO2）生物活性、抗压强度等经深入研究，被认为可以作为组织工程骨支架材料。BMSCs 具有增殖分化、免疫调节、扩增方便等优点，但有限的增殖能力、长期培养细胞活力易丧失等因素限制了其发展[1]。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）表现出无限增长和分化能力[2]，但其临床使用的安全性及其衍生物尚未完全阐明[3-4]。近年有研究报道采用 iPS 来源 MSCs（iPS-MSCs）靶向骨和/或软骨修复[5-9]，故本实验采用 iPS-MSCs 作为种子细胞。BMP 可诱导动物或人 BMSCs 分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，且 BMP-2 可增强骨缺损愈合过程中 BMSCs 成骨分化能力[10-11]。但 BMP-2 循环半衰期相当短，如果通过静脉注射使用，血液中的酶很容易使 BMP-2 失活[12-13]；另一个缺点是静脉注射 BMP-2 可能产生爆发效应，导致软组织血肿和骨吸收现象[14]。而壳聚糖的递送系统能够使 BMP-2 在特定位置持续释放[15]。故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植人 iPS-MSCs ，与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料体外共培养，探索缓释系统对 iPS-MSCs 成骨分化作用，并观察 iPS-MSCs 在HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上的黏附及活性，为后期体内研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
β-甘油磷酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；ALP 试剂盒、一抗、FITC 标记二抗、Hoechst（碧云天生物技术公司）；RPMI1640 完全培养基、壳聚糖粉末、BMP-2（Sigma 公司，美国）；iPS-MSCs（本课题组黄小龙提供）；明胶粉末、氯仿、异丙醇、无水乙醇、乙酸异戊酯（上海国药集团）；HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料（上海大学材料学院）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；DEPC 处理水、2.5% 戊二醛（上海诺辰生物技术有限公司）；SYBR Green PCR 试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）；4% 多聚甲醛（上海润捷化学试剂有限公司）；5%FBS（HyClone 公司，美国）。
低温冷冻离心机（Sigma 公司，美国）；倒置显微镜、荧光显微镜（Leica 公司，德国）；酶联免疫测试仪（Thermo Scientific Varioskan Flash 公司，美国）；ABI-7500 RT-PCR 仪（Thermo Fisher 公司，美国）；S4800 扫描电镜（日立公司，日本）。
1.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统构建及观测
1.2.1 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球构建
采用油包水相溶液法制备 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球。具体方法：① 取 1 g 明胶粉末于 50°C 溶解于 10 mL 去离子水，500 r/min 磁力搅拌下将其逐滴加入预加热至 50°C 的 60 mL 橄榄油中，持续搅拌下乳化 10 min；乳化液在搅拌中逐渐冷却至 4°C，形成固态微球，时间约 40 min。4°C 丙酮和乙醇分别漂洗 3 次，得到明胶微球，冻干。② 将制备的冻干明胶微球分散加入制备好的含 50 mmol/L 乙二醛的乙醇溶液中，室温 500 r/min 磁力搅拌 10 h，离心沉淀，将沉淀用乙醇洗涤 2 次，冻干；再用 100 µm 和 50 µm 滤网过滤，得到明胶微球。③ 将壳聚糖粉末溶于 0.75%（V/V）乙酸水溶液中制得 1.5%（W/V）壳聚糖溶液，待完全溶解后用 0.45 µm 滤膜过滤，4°C 保存。将 β-甘油磷酸钠溶于去离子水得到 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液，0.22 µm 滤膜过滤，4°C 保存。④ 将上述明胶微球加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，调节 pH 值至 6.3；再将溶解后的 BMP-2 加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，将 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液在 500 r/min 磁力搅拌下逐滴加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，使最后溶液含 β-甘油磷酸钠溶度为 88 mmol/L，pH 值约 7.2。将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球在 37°C 孵育 3 h。以上步骤均在无菌条件下进行。
1.2.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球药物包封率、载药率和体外缓释速率检测
采用 ELISA 试剂盒法检测，具体方法：取 5 mL 试管 3 支，每支试管中置入 150 mg BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球，各加 PBS（pH7.2）2 mL，37℃ 水浴振荡；分别于 6 h、12 h 及 1、2、3、6、9、12、15 d，每支试管各取上清液 100 µL，测定波长 450 nm 及校准 570 nm 处的吸光度（A）值，根据标准曲线方程计算上清液中 BMP-2 浓度，从而计算出上清液中 BMP-2 含量。按以下公式计算各指标：① 药物包封率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/BMP-2 总含量×100%；② 载药率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/微球总质量（150 mg）×100%；③ 体外缓释速率=上清液 BMP-2 含量/BMP-2 总含量×100%，并绘制 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球累积释放曲线。
1.2.3 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球形态观察
将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球裁剪成 3 mm×1 mm 大小，固定于样本台，扫描电镜观察微球表面结构。
1.3 支架材料-微球-细胞共培养体系的建立及相关观测
1.3.1 共培养体系的建立
将 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料高温灭菌后，用无菌 0.01%（W/V）多聚赖氨酸浸泡过夜，无菌条件下晾干，然后放入培养皿并用 RPMI1640 完全培养基浸润。在培养皿底部放置磁铁，将纯化后的 iPS-MSCs 和 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统制成悬浮液，然后逐滴缓慢滴至 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上。RPMI1640 完全培养基培养，置于 37℃、5%CO2 培养箱内液面下培养 2 周，细胞融合后改为气−液界面培养 10 d，作为实验组。另外，同上法将 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料仅和纯化后的 iPS-MSCs 共培养，作为对照组。
1.3.2 ALP 分泌量检测
两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，采用 ALP 检测试剂盒检测 ALP 分泌量。
1.3.3 RT-PCR 检测
两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，按 miRNA 试剂盒说明书进行操作。RT-PCR 扩增程序：热变性 95℃、10 min；扩增 95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s；40 个循环。数据采用仪器自带软件分析 ABI Prism 7500 SDS Software 分析，采用 2–ΔΔCt法计算目的基因［核心结合因子 α1（core binding factor α1，Cbfa1）、Ⅰ型胶原、锌指结构转录因子（Osterix，OSX）］相对表达量。目的基因引物序列见表 1。
表1
RT-PCR 检测目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of genes
1.3.4 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达
两组共培养体系体外培养 14 d 取出，PBS 漂洗 1 次，4% 多聚甲醛固定 15～30 min，再用 PBS 漂洗 3 min×2 次；3.5%FBS 室温下封闭 15 min，不洗；一抗Ⅰ型胶原抗体 4℃ 孵育过夜，PBS 洗 5 min×3 次；滴加二抗工作液，37℃ 孵育 1 h；室温避光孵育 Hoechst 15 min；荧光显微镜下观察。
1.3.5 扫描电镜观察细胞爬行及黏附状态
两组共培养体系培养 14 d 后取出，4℃ 预冷 PBS 漂洗，2.5% 冷戊二醛固定 24 h；吸出固定液，PBS 漂洗，彻底除去戊二醛；梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统相关观测
2.1.1 药物包封率、载药率和体外缓释速率
① 药物包封率：在 1 d 内微球的药物包封率均高达 90% 以上，随时间推移药物包封率逐渐降低，但在 15 d 时仍有 44.49%±0.20%。见图 1a。② 载药率：在 1 d 内微球的载药率均达 60% 以上，随时间推移载药率缓慢下降，15 d 时仍有 29.6%±0.14%。见图 1b。③ 体外缓释速率：BMP-2 的释放表现出阶段性释放规律，前 1 d 内释放缓慢，处于适应阶段；1～6 d 表现为 rhBMP-2 爆发性释放阶段，第 6 天累积释放率达 44.27%±0.30%；之后逐渐进入 BMP-2 缓慢释放阶段（6～12 d），第 12 天时累积释放率达 53.22%±0.18%；最后进入稳定阶段（12～15 d），第 15 天时累积释放率为 55.50%±0.20%。见图 1 c。
图1
BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球 ELISA 检测
a. 药物包封率；b. 载药率；c. 体外缓释速率
Figure1. ELISA detection of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheresa. Drug encapsulation efficiency; b. Drug loading; c. In vitro sustained release rate
2.1.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察
扫描电镜观察示 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球的球形良好，球形表面较光滑，其直径约为（255±26）μm。见图 2。
图2
BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察（×200）
Figure2.
Scanning electron microscopy observation of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microsphere (×200)
2.2 共培养体系相关观测
2.2.1 ALP 分泌量检测
随培养时间延长，两组 ALP 分泌量均逐渐增加；各时间点实验组 ALP 分泌量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
两组培养各时间点 ALP 分泌量检测
Figure3.
Detection of ALP secretion at different time points in the two groups
2.2.2 RT-PCR 检测
随培养时间延长，对照组各目的基因相对表达量无明显变化；实验组各目的基因相对表达量均逐渐增加，其中 Cbfa1 在 3～7 d 增加明显，Ⅰ型胶原在 7～10 d 增加明显，OSX 增加趋势较均匀，10 d 后各目的基因表达增幅均降低。各时间点实验组各目的基因相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
RT-PCR 检测两组培养各时间点各基因相对表达量
a. Cbfa1；b. Ⅰ型胶原；c. OSX
Figure4. RT-PCR detection of relative expression of genes in the two groups at different time pointsa. Cbfa1; b. Collagen type Ⅰ; c. OSX
2.2.3 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达
荧光显微镜观察示，实验组荧光数量明显多于对照组，即Ⅰ型胶原表达水平高于对照组；细胞均能较均匀地分布于材料上，细胞形态良好。见图 5。
图5
两组培养 14 d 免疫组织化学染色观察（×200）
从左至右依次为 Hoechst 染色、Ⅰ型胶原染色和两种染色重叠 a. 对照组；b. 实验组
Figure5. Immunohistochemical staining at 14 days after culture in the two groups (×200)From left to right for Hoechst staining, Collagen type Ⅰ staining, and merge staining, respectively a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 扫描电镜观察
对照组材料表面均匀分布着 iPS-MSCs，细胞黏附良好且数量较多，可见圆球状的 iPS-MSCs 细胞核、条索样细胞树突与轴突，细胞生长正常，形态良好。实验组可见 iPS-MSCs 的细胞核与 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统中的明胶微球有效黏附在一起，细胞核旁的细小灰色部分为细胞的树突与轴突。见图 6。
图6
两组培养 14 d 扫描电镜观察
箭头示细胞核 a. 对照组（×500）；b. 实验组（×200）
Figure6. Scanning electron microscopy observation at 14 days after culture in the two groupsArrow indicated nuclei a. Control group (×500); b. Experimental group (×200)
3 讨论
ZrO2 作为 HA 增强体后，可获得力学性能和生物相容性俱佳的生物复合材料[16]。由于 HA/ZrO2 致密体强度过大，同时也带来了应力遮蔽的问题[17]。故将 HA/ZrO2 致密体制成生物多孔泡沫陶瓷材料后，不仅可调节其强度，还有利于营养物质和代谢产物在其内的运输，提供了稳定的细胞外基质沉积、储存场所，促进了 iPS-MSCs 在其内的繁殖和迁移[18-19]。这也是 HA/ZrO2 生物多孔泡沫陶瓷材料的最大优势所在。
BMP 具有激活成熟成骨细胞中 ALP 活性的作用，也可作为 iPS 和 BMSCs 成骨分化的标志物[20]。 BMP 已初步应用于脊柱外科临床[21]。壳聚糖作为一种无毒缓释载体，其带正电荷和-NH2 基团的特性使其可与带负电荷的聚合物、大分子蛋白相互作用[22]。因 BMP-2 可能会产生爆发效应，故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统缓解 BMP-2 的爆发效应。壳聚糖对药物的包封率和释放率受壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和浓度等影响，既往研究表明[23]，利用壳聚糖承载缓释牛血清白蛋白，当壳聚糖相对分子质量从 10×103提高到 210×103，牛血清白蛋白的包封率提高约 2 倍，牛血清白蛋白的释放速率从 73.9% 降至 17.6%。黄鑫等[24]采用乳化交联法制备出的 BMP-2 壳聚糖缓释微球包封率达到 85.4%±4.2%，前 10 d BMP-2 累积释药率为 62.5%±3.6%。壳聚糖作为 BMP-2 缓释系统载体的潜力有待进一步挖掘。本实验制备的 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统，在 1 d 内其包封率高达 90% 以上，随时间推移包封率逐渐降低，但 15 d 时仍有 44.49%±0.20%；1 d 内载药率达 60%，之后缓慢下降，15 d 时仍达 29.6%±0.14%；体外缓释速率得到显著控制，15 d 时为 55.50%±0.20%。壳聚糖水凝胶缓释系统可使 BMP-2 的活性延长，大大提高了 BMP-2 的生物利用度。
种子细胞必须具有较强的扩增能力，并能在支架上黏附生长。BMSCs 作为一种公认的种子细胞，不仅具有多向分化潜能，同时也是基因治疗适宜的细胞载体[25-26]。但其获取易造成额外损伤，且增殖能力会随供体年龄的增长而下降。而胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的获取要破坏早期的胚囊，有悖伦理道德[27-28]。而 iPS 具有和 ESCs 类似甚至优于 ESCs 的特性，同时又不存在伦理和免疫排斥问题[29]。考虑到直接应用 iPS 或 ESCs 可能有形成畸胎瘤的潜在风险，因此我们采用 iPS 来源的 MSCs 作为新型组织工程骨种子细胞。
本实验先将 iPS-MSCs 和 HA/ZrO2 共培养，再将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统与其复合共培养，并与单纯 HA/ZrO2 复合 iPS-MSCs 进行比较，行 ALP 分泌量检测、RT-PCR 检测、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果显示，实验组培养 14 d ALP 分泌量明显高于对照组，表明 BMP-2 促进了 iPS-MSCs 中 ALP 表达，增强了 iPS-MSCs 成骨分化能力[26]。MSCs 可增殖分化为成骨细胞，具备成骨能力[30-33]，本实验结果显示 iPS-MSCs 也具有成骨分化能力。对照组在无缓释系统的作用下，Cbfa1、Ⅰ型胶原和 OSX 基因相对表达量随时间推移无明显变化；而实验组随时间推移，各目的基因相对表达量均增加，同时Ⅰ型胶原表达也显著多于对照组，表明 BMP-2 增强了 iPS-MSCs 成骨分化潜能[34]。扫描电镜观察可见 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统可包裹细胞；同时表面可见均匀分布的细胞，细胞与材料黏附良好，且生长正常，提示 iPS-MSCs 可在 HA/ZrO2 贴壁生长。故以 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料，有望成为未来组织工程骨研究和应用的发展方向。
综上述，本研究结果表明，BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统具有较好的药物包封率及载药率，可延长 BMP-2 活性时间，BMP-2 可促进 iPS-MSCs 成骨分化。同时 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料在体外共培养后，iPS-BMSCs 黏附良好，细胞活性较好。下一步我们将对 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料的体内共培养进行研究。
大段骨缺损修复一直是骨科临床难题之一。组织工程骨理念的提出，为骨缺损修复提供了新思路和新途径。组织工程骨是由种子细胞、支架、生物活性物质等组成，通过这些物质的相互调控，可促进骨组织愈合。羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/二氧化锆（ZrO2）生物活性、抗压强度等经深入研究，被认为可以作为组织工程骨支架材料。BMSCs 具有增殖分化、免疫调节、扩增方便等优点，但有限的增殖能力、长期培养细胞活力易丧失等因素限制了其发展[1]。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）表现出无限增长和分化能力[2]，但其临床使用的安全性及其衍生物尚未完全阐明[3-4]。近年有研究报道采用 iPS 来源 MSCs（iPS-MSCs）靶向骨和/或软骨修复[5-9]，故本实验采用 iPS-MSCs 作为种子细胞。BMP 可诱导动物或人 BMSCs 分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织，且 BMP-2 可增强骨缺损愈合过程中 BMSCs 成骨分化能力[10-11]。但 BMP-2 循环半衰期相当短，如果通过静脉注射使用，血液中的酶很容易使 BMP-2 失活[12-13]；另一个缺点是静脉注射 BMP-2 可能产生爆发效应，导致软组织血肿和骨吸收现象[14]。而壳聚糖的递送系统能够使 BMP-2 在特定位置持续释放[15]。故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植人 iPS-MSCs ，与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料体外共培养，探索缓释系统对 iPS-MSCs 成骨分化作用，并观察 iPS-MSCs 在HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上的黏附及活性，为后期体内研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
β-甘油磷酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；ALP 试剂盒、一抗、FITC 标记二抗、Hoechst（碧云天生物技术公司）；RPMI1640 完全培养基、壳聚糖粉末、BMP-2（Sigma 公司，美国）；iPS-MSCs（本课题组黄小龙提供）；明胶粉末、氯仿、异丙醇、无水乙醇、乙酸异戊酯（上海国药集团）；HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料（上海大学材料学院）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）；DEPC 处理水、2.5% 戊二醛（上海诺辰生物技术有限公司）；SYBR Green PCR 试剂盒、逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）；4% 多聚甲醛（上海润捷化学试剂有限公司）；5%FBS（HyClone 公司，美国）。
低温冷冻离心机（Sigma 公司，美国）；倒置显微镜、荧光显微镜（Leica 公司，德国）；酶联免疫测试仪（Thermo Scientific Varioskan Flash 公司，美国）；ABI-7500 RT-PCR 仪（Thermo Fisher 公司，美国）；S4800 扫描电镜（日立公司，日本）。
1.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统构建及观测
1.2.1 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球构建
采用油包水相溶液法制备 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球。具体方法：① 取 1 g 明胶粉末于 50°C 溶解于 10 mL 去离子水，500 r/min 磁力搅拌下将其逐滴加入预加热至 50°C 的 60 mL 橄榄油中，持续搅拌下乳化 10 min；乳化液在搅拌中逐渐冷却至 4°C，形成固态微球，时间约 40 min。4°C 丙酮和乙醇分别漂洗 3 次，得到明胶微球，冻干。② 将制备的冻干明胶微球分散加入制备好的含 50 mmol/L 乙二醛的乙醇溶液中，室温 500 r/min 磁力搅拌 10 h，离心沉淀，将沉淀用乙醇洗涤 2 次，冻干；再用 100 µm 和 50 µm 滤网过滤，得到明胶微球。③ 将壳聚糖粉末溶于 0.75%（V/V）乙酸水溶液中制得 1.5%（W/V）壳聚糖溶液，待完全溶解后用 0.45 µm 滤膜过滤，4°C 保存。将 β-甘油磷酸钠溶于去离子水得到 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液，0.22 µm 滤膜过滤，4°C 保存。④ 将上述明胶微球加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，调节 pH 值至 6.3；再将溶解后的 BMP-2 加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，将 50%（W/V）β-甘油磷酸钠溶液在 500 r/min 磁力搅拌下逐滴加入 50 mL 1.5%（W/V）壳聚糖溶液中，使最后溶液含 β-甘油磷酸钠溶度为 88 mmol/L，pH 值约 7.2。将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球在 37°C 孵育 3 h。以上步骤均在无菌条件下进行。
1.2.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球药物包封率、载药率和体外缓释速率检测
采用 ELISA 试剂盒法检测，具体方法：取 5 mL 试管 3 支，每支试管中置入 150 mg BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球，各加 PBS（pH7.2）2 mL，37℃ 水浴振荡；分别于 6 h、12 h 及 1、2、3、6、9、12、15 d，每支试管各取上清液 100 µL，测定波长 450 nm 及校准 570 nm 处的吸光度（A）值，根据标准曲线方程计算上清液中 BMP-2 浓度，从而计算出上清液中 BMP-2 含量。按以下公式计算各指标：① 药物包封率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/BMP-2 总含量×100%；② 载药率=（BMP-2 总含量−上清液 BMP-2 含量）/微球总质量（150 mg）×100%；③ 体外缓释速率=上清液 BMP-2 含量/BMP-2 总含量×100%，并绘制 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球累积释放曲线。
1.2.3 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球形态观察
将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球裁剪成 3 mm×1 mm 大小，固定于样本台，扫描电镜观察微球表面结构。
1.3 支架材料-微球-细胞共培养体系的建立及相关观测
1.3.1 共培养体系的建立
将 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料高温灭菌后，用无菌 0.01%（W/V）多聚赖氨酸浸泡过夜，无菌条件下晾干，然后放入培养皿并用 RPMI1640 完全培养基浸润。在培养皿底部放置磁铁，将纯化后的 iPS-MSCs 和 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统制成悬浮液，然后逐滴缓慢滴至 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料上。RPMI1640 完全培养基培养，置于 37℃、5%CO2 培养箱内液面下培养 2 周，细胞融合后改为气−液界面培养 10 d，作为实验组。另外，同上法将 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料仅和纯化后的 iPS-MSCs 共培养，作为对照组。
1.3.2 ALP 分泌量检测
两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，采用 ALP 检测试剂盒检测 ALP 分泌量。
1.3.3 RT-PCR 检测
两组共培养体系体外培养 3、7、10、14 d，按 miRNA 试剂盒说明书进行操作。RT-PCR 扩增程序：热变性 95℃、10 min；扩增 95℃、20 s，62℃、30 s，72℃、30 s；40 个循环。数据采用仪器自带软件分析 ABI Prism 7500 SDS Software 分析，采用 2–ΔΔCt法计算目的基因［核心结合因子 α1（core binding factor α1，Cbfa1）、Ⅰ型胶原、锌指结构转录因子（Osterix，OSX）］相对表达量。目的基因引物序列见表 1。
表1
RT-PCR 检测目的基因引物序列
Table1.
Primer sequence of genes
1.3.4 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达
两组共培养体系体外培养 14 d 取出，PBS 漂洗 1 次，4% 多聚甲醛固定 15～30 min，再用 PBS 漂洗 3 min×2 次；3.5%FBS 室温下封闭 15 min，不洗；一抗Ⅰ型胶原抗体 4℃ 孵育过夜，PBS 洗 5 min×3 次；滴加二抗工作液，37℃ 孵育 1 h；室温避光孵育 Hoechst 15 min；荧光显微镜下观察。
1.3.5 扫描电镜观察细胞爬行及黏附状态
两组共培养体系培养 14 d 后取出，4℃ 预冷 PBS 漂洗，2.5% 冷戊二醛固定 24 h；吸出固定液，PBS 漂洗，彻底除去戊二醛；梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统相关观测
2.1.1 药物包封率、载药率和体外缓释速率
① 药物包封率：在 1 d 内微球的药物包封率均高达 90% 以上，随时间推移药物包封率逐渐降低，但在 15 d 时仍有 44.49%±0.20%。见图 1a。② 载药率：在 1 d 内微球的载药率均达 60% 以上，随时间推移载药率缓慢下降，15 d 时仍有 29.6%±0.14%。见图 1b。③ 体外缓释速率：BMP-2 的释放表现出阶段性释放规律，前 1 d 内释放缓慢，处于适应阶段；1～6 d 表现为 rhBMP-2 爆发性释放阶段，第 6 天累积释放率达 44.27%±0.30%；之后逐渐进入 BMP-2 缓慢释放阶段（6～12 d），第 12 天时累积释放率达 53.22%±0.18%；最后进入稳定阶段（12～15 d），第 15 天时累积释放率为 55.50%±0.20%。见图 1 c。
图1
BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球 ELISA 检测
a. 药物包封率；b. 载药率；c. 体外缓释速率
Figure1. ELISA detection of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microspheresa. Drug encapsulation efficiency; b. Drug loading; c. In vitro sustained release rate
2.1.2 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察
扫描电镜观察示 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球的球形良好，球形表面较光滑，其直径约为（255±26）μm。见图 2。
图2
BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶微球扫描电镜观察（×200）
Figure2.
Scanning electron microscopy observation of BMP-2 gelatin/chitosan hydrogel microsphere (×200)
2.2 共培养体系相关观测
2.2.1 ALP 分泌量检测
随培养时间延长，两组 ALP 分泌量均逐渐增加；各时间点实验组 ALP 分泌量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
两组培养各时间点 ALP 分泌量检测
Figure3.
Detection of ALP secretion at different time points in the two groups
2.2.2 RT-PCR 检测
随培养时间延长，对照组各目的基因相对表达量无明显变化；实验组各目的基因相对表达量均逐渐增加，其中 Cbfa1 在 3～7 d 增加明显，Ⅰ型胶原在 7～10 d 增加明显，OSX 增加趋势较均匀，10 d 后各目的基因表达增幅均降低。各时间点实验组各目的基因相对表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
RT-PCR 检测两组培养各时间点各基因相对表达量
a. Cbfa1；b. Ⅰ型胶原；c. OSX
Figure4. RT-PCR detection of relative expression of genes in the two groups at different time pointsa. Cbfa1; b. Collagen type Ⅰ; c. OSX
2.2.3 免疫组织化学染色检测Ⅰ型胶原表达
荧光显微镜观察示，实验组荧光数量明显多于对照组，即Ⅰ型胶原表达水平高于对照组；细胞均能较均匀地分布于材料上，细胞形态良好。见图 5。
图5
两组培养 14 d 免疫组织化学染色观察（×200）
从左至右依次为 Hoechst 染色、Ⅰ型胶原染色和两种染色重叠 a. 对照组；b. 实验组
Figure5. Immunohistochemical staining at 14 days after culture in the two groups (×200)From left to right for Hoechst staining, Collagen type Ⅰ staining, and merge staining, respectively a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 扫描电镜观察
对照组材料表面均匀分布着 iPS-MSCs，细胞黏附良好且数量较多，可见圆球状的 iPS-MSCs 细胞核、条索样细胞树突与轴突，细胞生长正常，形态良好。实验组可见 iPS-MSCs 的细胞核与 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统中的明胶微球有效黏附在一起，细胞核旁的细小灰色部分为细胞的树突与轴突。见图 6。
图6
两组培养 14 d 扫描电镜观察
箭头示细胞核 a. 对照组（×500）；b. 实验组（×200）
Figure6. Scanning electron microscopy observation at 14 days after culture in the two groupsArrow indicated nuclei a. Control group (×500); b. Experimental group (×200)
3 讨论
ZrO2 作为 HA 增强体后，可获得力学性能和生物相容性俱佳的生物复合材料[16]。由于 HA/ZrO2 致密体强度过大，同时也带来了应力遮蔽的问题[17]。故将 HA/ZrO2 致密体制成生物多孔泡沫陶瓷材料后，不仅可调节其强度，还有利于营养物质和代谢产物在其内的运输，提供了稳定的细胞外基质沉积、储存场所，促进了 iPS-MSCs 在其内的繁殖和迁移[18-19]。这也是 HA/ZrO2 生物多孔泡沫陶瓷材料的最大优势所在。
BMP 具有激活成熟成骨细胞中 ALP 活性的作用，也可作为 iPS 和 BMSCs 成骨分化的标志物[20]。 BMP 已初步应用于脊柱外科临床[21]。壳聚糖作为一种无毒缓释载体，其带正电荷和-NH2 基团的特性使其可与带负电荷的聚合物、大分子蛋白相互作用[22]。因 BMP-2 可能会产生爆发效应，故本实验采用 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统缓解 BMP-2 的爆发效应。壳聚糖对药物的包封率和释放率受壳聚糖相对分子质量、脱乙酰度和浓度等影响，既往研究表明[23]，利用壳聚糖承载缓释牛血清白蛋白，当壳聚糖相对分子质量从 10×103提高到 210×103，牛血清白蛋白的包封率提高约 2 倍，牛血清白蛋白的释放速率从 73.9% 降至 17.6%。黄鑫等[24]采用乳化交联法制备出的 BMP-2 壳聚糖缓释微球包封率达到 85.4%±4.2%，前 10 d BMP-2 累积释药率为 62.5%±3.6%。壳聚糖作为 BMP-2 缓释系统载体的潜力有待进一步挖掘。本实验制备的 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统，在 1 d 内其包封率高达 90% 以上，随时间推移包封率逐渐降低，但 15 d 时仍有 44.49%±0.20%；1 d 内载药率达 60%，之后缓慢下降，15 d 时仍达 29.6%±0.14%；体外缓释速率得到显著控制，15 d 时为 55.50%±0.20%。壳聚糖水凝胶缓释系统可使 BMP-2 的活性延长，大大提高了 BMP-2 的生物利用度。
种子细胞必须具有较强的扩增能力，并能在支架上黏附生长。BMSCs 作为一种公认的种子细胞，不仅具有多向分化潜能，同时也是基因治疗适宜的细胞载体[25-26]。但其获取易造成额外损伤，且增殖能力会随供体年龄的增长而下降。而胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的获取要破坏早期的胚囊，有悖伦理道德[27-28]。而 iPS 具有和 ESCs 类似甚至优于 ESCs 的特性，同时又不存在伦理和免疫排斥问题[29]。考虑到直接应用 iPS 或 ESCs 可能有形成畸胎瘤的潜在风险，因此我们采用 iPS 来源的 MSCs 作为新型组织工程骨种子细胞。
本实验先将 iPS-MSCs 和 HA/ZrO2 共培养，再将 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统与其复合共培养，并与单纯 HA/ZrO2 复合 iPS-MSCs 进行比较，行 ALP 分泌量检测、RT-PCR 检测、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果显示，实验组培养 14 d ALP 分泌量明显高于对照组，表明 BMP-2 促进了 iPS-MSCs 中 ALP 表达，增强了 iPS-MSCs 成骨分化能力[26]。MSCs 可增殖分化为成骨细胞，具备成骨能力[30-33]，本实验结果显示 iPS-MSCs 也具有成骨分化能力。对照组在无缓释系统的作用下，Cbfa1、Ⅰ型胶原和 OSX 基因相对表达量随时间推移无明显变化；而实验组随时间推移，各目的基因相对表达量均增加，同时Ⅰ型胶原表达也显著多于对照组，表明 BMP-2 增强了 iPS-MSCs 成骨分化潜能[34]。扫描电镜观察可见 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统可包裹细胞；同时表面可见均匀分布的细胞，细胞与材料黏附良好，且生长正常，提示 iPS-MSCs 可在 HA/ZrO2 贴壁生长。故以 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料，有望成为未来组织工程骨研究和应用的发展方向。
综上述，本研究结果表明，BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统具有较好的药物包封率及载药率，可延长 BMP-2 活性时间，BMP-2 可促进 iPS-MSCs 成骨分化。同时 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料在体外共培养后，iPS-BMSCs 黏附良好，细胞活性较好。下一步我们将对 BMP-2 明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合种植 iPS-MSCs 与 HA/ZrO2 多孔生物泡沫陶瓷材料的体内共培养进行研究。
