引用本文： 斯海波, 梁明玮, 程惊秋, 沈彬. 软骨前体细胞及微小 RNA-140 在骨关节炎软骨损伤修复中的作用. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(5): 650-658. doi: 10.7507/1002-1892.201806060 复制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以进行性关节软骨损伤、软骨下骨改变、骨质增生及滑膜炎性改变等为特征的常见退行性关节疾病。目前 OA 的发病机制尚未完全阐明，且缺乏有效延缓、阻止或逆转病程的治疗手段，已成为中老年人群疼痛和致残的主要原因之一[1]。关节软骨损伤在 OA 发病机制中起关键作用，但由于无血管和神经营养，关节软骨组织的自我更新及修复能力非常弱，目前各种修复治疗策略并未取得满意疗效[2-3]。近年有研究发现关节软骨组织中存在一类具有干细胞特性的软骨前体细胞（cartilage progenitor cells，CPCs），这为软骨损伤修复研究提供了新的切入点[3]。微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）具有软骨特异性，在人正常关节软骨组织中稳定表达，对软骨发育、稳态维持及损伤修复起重要调控作用[4-6]，最新研究发现 miR-140 具有较强的促干细胞成软骨细胞分化能力[7]。本文就 CPCs 及 miR-140 在 OA 软骨损伤修复中的作用及应用前景作一综述。
1 诱导活化 CPCs 是促进 OA 软骨损伤修复的潜在策略
1.1 干细胞修复 OA 软骨损伤的研究现状
关节软骨属于透明软骨，是由细胞及细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）构成的特化致密结缔组织，其中软骨细胞量少，仅占正常软骨组织的 5%，合成包括各种胶原蛋白、蛋白多糖及非胶原蛋白等 ECM 成分[8]。由于缺乏血管和神经营养，关节软骨自我修复能力有限，MSCs 因具有很强的自我更新和形成特定组织的能力，近年来被作为软骨损伤修复的种子细胞进行了大量研究[2]。既往已有较多文献报道了不同组织来源的 MSCs，包括 BMSCs、脂肪来源干细胞（adipose-derived MSCs，ADSCs）及滑液来源干细胞等，体外扩增后通过局部移植或注射方式植入体内，可在一定程度上促进 OA 软骨损伤修复、延缓 OA 进程[3, 9-12]。然而，MSCs 体外扩增后容易发生衰老、终末分化等改变[2, 9]。同时还存在一定组织特异性问题，即 MSCs 再生及分化能力与其组织来源密切相关[3, 10]。比如，BMSCs 具有较强的自发成骨分化潜能，即使在体外成软骨诱导条件下，其合成的基质仍主要是Ⅰ型胶原，产生的是纤维软骨，而不是正常的透明软骨；而且 BMSCs 潜在的肥大分化能力在一定程度上可通过软骨内成骨途径诱导新生的纤维软骨组织钙化[13-14]。因此，非软骨来源 MSCs 在软骨损伤修复中的应用也存在一定局限性。近年在软骨组织中发现一类具有干细胞特性的软骨细胞亚群，为 OA 软骨损伤修复提供了新的种子细胞及干预靶点。
1.2 CPCs 的发现及特征
既往学者们认为成熟软骨细胞是关节软骨组织中唯一存在的细胞类型，但 Barbero 等[15]发现软骨来源细胞经单层培养扩增后，小部分细胞具有细胞克隆及三系分化（成骨、成软骨及成脂分化）能力。随后，多项研究证实关节软骨中确实存在一类具有自我增殖性、干细胞表面抗原表达特性及多向分化潜能的软骨细胞亚群，即 CPCs[7, 16-17]。CPCs 主要分散在软骨表层，表达 CD105、CD106、CD146、CD166、Notch-1、Integrin α5β1 及 SOX-9 等干细胞标志分子，不表达造血干细胞和白细胞特异标志分子 CD34 和 CD45[16, 18]，这些特征均符合国际细胞治疗协会（ISCT）2016 年定义的干细胞标准[19]，其中“CD105+/CD166+、CD34-、CD45-”组合已成为目前最常用的 CPCs 初步筛选及鉴定标准之一。
1.3 CPCs 在 OA 软骨损伤修复中的应用前景
Pretzel 等[20] 及 Alsalameh 等[21]均报道 OA 软骨细胞中 CPCs（CD105+/CD166+）比例略高于正常软骨细胞。Mazor 等[22]进一步报道轻度 OA 软骨细胞 CD105、CD166 和 SOX-9 mRNA 水平高于重度 OA 软骨细胞。Xia 等[23]也报道重度 OA 软骨组织中 CPCs 比例（10.61%±6.97%）明显低于正常软骨组织（18.44%±9.97%），提示 CPCs 与 OA 发生发展密切相关。Seol 等[24]采用荧光蛋白标记示踪技术发现软骨损伤可刺激 CPCs 归巢机制启动，通过诱导 CPCs 增殖分化实现受损部位细胞群恢复，可促进软骨损伤修复。McCarthy 等[25]发现 CPCs 多向分化能力和 BMSCs 相当，但自发成软骨分化能力及再生软骨组织功能优于 BMSCs。然而，Tao 等[26]报道在 OA 早期软骨损伤部位虽有一定数量的 CPCs 聚集，但其自主活化及成软骨分化能力并不能达到自主软骨完全修复的要求。因此，诱导活化 CPCs 是促进 OA 早期软骨损伤修复的潜在策略。
从自发成软骨分化能力及再生软骨组织功能上比较，CPCs 优于其他组织来源 MSCs（如 BMSCs、ADSCs、滑膜来源干细胞等），在 OA 早期内源性软骨损伤修复中更具优势[3]。然而，如果作为修复的种子细胞，目前大量获得 CPCs 的技术相对不成熟。根据现有文献报道结果，非软骨来源 MSCs 更具优势，尤其是 BMSCs 及 ADSCs，两者用于 OA 的研究相对较多且已有临床研究报道[27-29]。为解决 CPCs 来源问题，学者们进行了相关研究。Togo 等[30]研究发现兔耳软骨膜中存在大量 CPCs，其具有良好的三系分化能力，比软骨组织来源软骨细胞具有更好的增殖分化能力，将 CPCs 接种在胶原海绵支架上并植入裸鼠中，4 周后可产生与软骨细胞组相似质量、富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的软骨组织，而作为对照的 BMSCs 软骨组织生成能力明显弱于 CPCs。Takebe 等[31]进一步构建了旋转壁容器生物反应器，将耳软骨来源 CPCs 接种至 pC-HAp/ChS（由胶原、羟基磷灰石和硫酸软骨素组成的多孔材料）支架后，利用该反应器进行三维培养，成功构建出具有独特的人关节软骨特性的软骨组织。这些研究提示耳软骨来源 CPCs 是软骨修复重建种子细胞来源之一，但后续仍需对 CPCs 来源及应用进行深入探索研究。
2 miR-140 是 CPCs 的潜在诱导活化因子
2.1 miR-140 参与 OA 发病机制
正常情况下软骨组织保持合成与分解代谢平衡，并受环境、信号通路及 miRNA 等多种因素调节[8]。miRNA 是一类高度保守、长约 22 个碱基对的非编码小 RNA，可在细胞质内以完全或部分互补形式与靶基因 mRNA 3’端非翻译区（untranslated region，UTR）结合，引起靶基因 mRNA 降解或翻译抑制，调控哺乳动物约 1/3 的 mRNA 翻译，在细胞分化、增殖、衰老及凋亡等方面起重要调控作用[4, 32]。miR-140 基因位于大鼠 8 号染色体、人类 16 号染色体短臂上编码 E3 泛素蛋白连接酶基因 Wwp2 的 16 号与 17 号外显子之间，具有高度保守性，主要在软骨组织中表达，具有软骨特异性[4]，在软骨生长发育、稳态维持及损伤修复过程中起重要作用[33]。
既往研究已证实 miR-140 在人正常关节软骨中稳定表达[4]，其中多数研究发现 OA 软骨组织或细胞中 miR-140 表达较正常软骨组织或细胞减少[34-35]，但 Swingler 等[36]也报道 miR-140 在 OA 软骨中表达较正常软骨明显增高。这可能与实验样品来源不同有关，如人体不同关节软骨、不同小鼠、不同细胞系等都会对实验结果造成影响，不同的实验方法、体内和体外实验之间的差异也会影响结果。虽然 miR-140 在 OA 软骨中的表达变化规律目前尚存争议，但这些研究均证实 miR-140 在关节软骨发育、稳态及功能维持方面发挥着重要的调控作用。膝关节是 OA 最常累及的关节之一，目前膝关节来源软骨组织及细胞相关研究均报道 OA 组 miR-140 表达较正常组显著降低，学者们也检测了人膝 OA 关节软骨及关节液中 miR-140 表达水平，发现 OA 组 miR-140 表达较正常组显著下降，其水平与 OA 的严重程度成显著负相关[37]，而上调 miR-140 表达可部分抑制膝软骨组织和细胞 OA 样改变，延缓 OA 进程[38-41]，这也提示 miR-140 参与 OA 发病机制，而进一步研发基于 miR-140 的 OA 治疗策略具有重要意义。
2.2 miR-140 对 CPCs 的潜在诱导活化作用及机制
既往研究发现，成熟间充质谱系细胞（包括成熟软骨细胞）可以通过“去分化”重编程回到干细胞状态，并表现出高增殖能力和多向分化潜能[3, 15]。同时，自发性软骨损伤修复是 CPCs 及成熟软骨细胞共同作用的结果，两者之间可能存在重叠作用[3]。Hossein 等[42]发现 miR-140 可诱导 BMSCs 向软骨细胞分化，其诱导作用甚至强于目前经典的 TGF-β3 成软骨分化诱导法，但在软骨细胞中暂无相关研究报道。因此，后续验证 miR-140 是否可调控 CPCs 与成熟软骨细胞亚群重编程，将为 miR-140 促进软骨损伤修复提供更多证据。
既往研究已证实 MSCs 及 CPCs 均表达 Notch 信号通路相关分子，而激活 Notch 信号对 MSCs 成软骨分化具有明显抑制作用[25, 43]。Grogan 等[44]发现 Notch 下游产物 HES1 及 HEY1 可与 DNA 序列中 SOX-9 增强子识别位点相结合，抑制 SOX-9 介导的Ⅱ型胶原α1 链（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）的转录激活，从而抑制软骨细胞特异性 COL2A1 启动子的活动。生物信息学分析发现 JAG1、解聚蛋白样金属蛋白酶 10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）及 HEY1 等 Notch 信号通路关键信号分子基因 3’端 UTR 均存在 miR-140 结合靶点，而 JAG1 介导的 Notch 信号通路抑制 MSCs 向软骨细胞分化[45]。此外，Khayrullin 等[46]在肌萎缩症中也发现 miR-140 可调控 DNER、JAG1 及 HEY1 等 Notch 通路关键分子表达。这些研究均提示 miR-140 具有通过抑制 Notch 信号通路而诱导活化 CPCs、促进 OA 软骨损伤修复的潜力，后续有待进一步验证。
3 基于 CPCs 及 miR-140 的 OA 治疗策略
3.1 强调 OA 早期软骨损伤修复的重要性
正常情况下，关节软骨细胞属于静止类细胞，其合成与分解代谢处于动态平衡，这对关节软骨稳态及功能维持起着至关重要的作用[3]。在各种内源性或外源性有害因素（如衰老、炎症、创伤等）的刺激下，软骨细胞可一定程度发生代偿性改变，以维持软骨细胞及组织稳态；当刺激因素持续存在并超过细胞代偿能力时，细胞代谢平衡被打破，软骨细胞发生终末分化，细胞凋亡程序启动并产生多种有害物质[1]。正常关节软骨表面光滑，而在 OA 早期软骨表面出现小裂隙、裂缝及纤维化等改变，损伤仅累及软骨表层区域，软骨细胞凋亡少、ECM 降解程度轻，此时修复表层软骨损伤尚有延迟、预防，甚至逆转 OA 进展的可能[8]。随着 OA 进展，相关病理改变逐渐加重，尤其在 OA 晚期，软骨细胞大量死亡、ECM 广泛降解、软骨严重缺损伴软骨下骨硬化、暴露，同时伴随滑膜炎、骨赘形成等改变，此时软骨损伤修复或再生的可能性极小，软骨修复治疗意义已不大，相应治疗多局限于临床症状控制（如镇痛、骨骼肌松弛药物等）和人工关节置换手术（单髁置换术、人工全膝关节置换术）[47-48]。因此，结合 CPCs 主要分散在软骨表层的特点，强调 OA 早期干预具有重要临床意义。
3.2 miR-140 在 OA 早期干预中的作用及潜在机制
关节软骨损伤、稳态失衡是 OA 的主要特征之一，其中以Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等 ECM 成分降解为主。既往研究已证实 miR-140 可直接调控基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、含血小板结合蛋白基序的 ADAMTS5、转录因子 Runx2 等多个基因，对软骨稳态起重要调控作用。MMP-13 及 ADAMTS5 是目前公认的最重要的两种软骨基质降解酶[49]，已证实 miR-140 可直接与 MMP-13 和 ADAMTS5 mRNA 3’端 UTR 位点结合，对其进行负调控[5, 50]。Runx2 是调控骨形成的主要转录因子之一，可通过诱导 MMP-13、Ⅹ型胶原及 ALP 等表达，进而促进软骨细胞终末分化及软骨内成骨过程，其在正常关节软骨细胞中几乎不表达，而在肥大软骨细胞中呈高表达[51-52]。Runx2 主要通过与 Smads 蛋白结合形成 Runx2-Smads 复合体起作用；Smad1 与 Smad3 竞争性结合 Runx2，前者激活 Runx2 活性，后者抑制 Runx2 活性[53-54]。Smad1、Smad3 分别是 BMP 和 TGF-β 信号通路关键信号分子[55]，目前已证实 BMP 通路受体 TGFBR1 是 miR-140 的直接作用靶点，上调 miR-140 可抑制 TGFBR1 及其下游 Smad1 的表达，Smad3 更多地结合 Runx2 并抑制其活性，这也提示 miR-140 可通过 TGF-β/BMP 通路调控软骨细胞稳态。
最近，Li 等[45]通过生物信息学手段预测出人 miR-140 存在 123 个潜在靶基因，通过基因功能富集分析发现，这些靶基因主要参与调节代谢进程、细胞交流、信号传导、化学刺激反应、干细胞增殖、细胞表面受体信号通路等生物过程，KEGG 通路分析发现 miR-140 的靶基因主要参与 Notch、TGF-β、PI3K/Akt、Hippo 等三十余条信号通路过程；进一步查阅文献发现，目前有 26 篇研究对 miR-140 靶点进行了报道，包含 23 个靶基因、涉及 7 条信号通路。因此，miR-140 在软骨细胞中可调控多个靶基因、参与多条信号通路、涉及多个生物过程，其在 OA 发病中的作用范围可能远超目前已发表文献报道的内容，值得进一步研究。
3.3 miR-140 在 OA 治疗中的应用策略
miR-140 是一种高度保守、主要在软骨组织中表达的非编码小 RNA，和其他 RNA 一样，其在体外及外周血中很容易降解，导致既往关于 miR-140 治疗 OA 的研究多集中在体外细胞或转基因动物中，这对后续探索 miR-140 治疗 OA 的指导作用有限。关节腔局部给药因其安全性获得广泛应用，是目前治疗 OA 的主要方式之一[38, 56-57]。有学者首次报道了关节腔注射 miR-140 可延缓大鼠 OA 进展[38]，但既往研究证实由于淋巴管及滑膜血管的作用，直接注射到关节内的药物或基因在关节液中清除速度快、停留时间短；同时，药物或基因在关节内的非靶向聚集也会降低软骨对它们的生物利用度，并加速从关节中清除，导致常常需要多次高剂量注射药物，而且操作繁琐、增加感染风险[58]。因此，为了增强 miR-140 软骨靶向递送效率及最小化药物剂量需求，构建具有良好安全性、软骨靶向性及高效递送 miR-140 的载体材料，对后续基于 miR-140 的 OA 治疗策略研发及临床转化具有重要意义。
目前已有研究报道多种 miRNA 递送载体，包括腺病毒、慢病毒、胶原蛋白支架、水凝胶等[57, 59-61]，进一步利用能选择性结合目标组织成分或具有生物功能的生化基团修饰，可提高载体材料的靶向性、药物递送效率及生物活性[56]。例如，Li 等[62]最近报道了 N-Cadherin 模拟肽修饰的自组装多肽纳米材料可增强 MSCs 的成软骨分化能力。软骨基质密集且呈高负电荷状态（主要源于蛋白多糖）是关节腔药物进入软骨组织的一大障碍。既往研究报道阳离子载体和带负电荷 ECM 之间的非特异性静电作用有利于药物快速渗透软骨，而且软骨基质高负电荷状态将大大增加阳离子载体的停留时间，从而使软骨从药物屏障转变成药物储存库[63]。目前已有研究报道阳离子纳米材料可通过静电作用高效递送表面呈负电荷的 miRNA[64]，选取合适的阳离子基团或分子修饰功能化载体材料不仅可作为软骨靶向、高效递送 miR-140 的载体，两者还可协同增强 OA 软骨损伤修复，具有良好的应用前景。
4 总结与展望
CPCs 与 OA 发生发展密切相关，虽然其具有良好的自我增殖性、干细胞表面抗原表达特性及多向分化潜能等特点，但其在 OA 软骨损伤部位自主活化及成软骨分化能力尚未达到软骨完全修复要求。miR-140 具有软骨特异性，以及抑制 Notch 信号通路、诱导活化 CPCs 并增强其增殖及成软骨分化的能力，从而促进 OA 软骨损伤修复的潜能。关节腔注射 miR-140 虽能在一定程度上延缓关节软骨退变，但也存在非靶向聚集、生物利用度低及清除快等问题，因此构建安全、软骨靶向且能高效递送 miR-140 的载体材料具有良好应用前景。此外，由于 CPCs 主要分散在软骨表层，而 OA 软骨损伤也开始于该层，因此强调 OA 早期干预至关重要。
综上述，miR-140 具有诱导活化 CPCs、促进 OA 早期软骨损伤修复的潜力，进一步探索 miR-140 在 OA 发生机制中的作用及研发基于 miR-140 新的 OA 治疗策略具有重要临床意义。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以进行性关节软骨损伤、软骨下骨改变、骨质增生及滑膜炎性改变等为特征的常见退行性关节疾病。目前 OA 的发病机制尚未完全阐明，且缺乏有效延缓、阻止或逆转病程的治疗手段，已成为中老年人群疼痛和致残的主要原因之一[1]。关节软骨损伤在 OA 发病机制中起关键作用，但由于无血管和神经营养，关节软骨组织的自我更新及修复能力非常弱，目前各种修复治疗策略并未取得满意疗效[2-3]。近年有研究发现关节软骨组织中存在一类具有干细胞特性的软骨前体细胞（cartilage progenitor cells，CPCs），这为软骨损伤修复研究提供了新的切入点[3]。微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）具有软骨特异性，在人正常关节软骨组织中稳定表达，对软骨发育、稳态维持及损伤修复起重要调控作用[4-6]，最新研究发现 miR-140 具有较强的促干细胞成软骨细胞分化能力[7]。本文就 CPCs 及 miR-140 在 OA 软骨损伤修复中的作用及应用前景作一综述。
1 诱导活化 CPCs 是促进 OA 软骨损伤修复的潜在策略
1.1 干细胞修复 OA 软骨损伤的研究现状
关节软骨属于透明软骨，是由细胞及细胞外基质（extra-cellular matrix，ECM）构成的特化致密结缔组织，其中软骨细胞量少，仅占正常软骨组织的 5%，合成包括各种胶原蛋白、蛋白多糖及非胶原蛋白等 ECM 成分[8]。由于缺乏血管和神经营养，关节软骨自我修复能力有限，MSCs 因具有很强的自我更新和形成特定组织的能力，近年来被作为软骨损伤修复的种子细胞进行了大量研究[2]。既往已有较多文献报道了不同组织来源的 MSCs，包括 BMSCs、脂肪来源干细胞（adipose-derived MSCs，ADSCs）及滑液来源干细胞等，体外扩增后通过局部移植或注射方式植入体内，可在一定程度上促进 OA 软骨损伤修复、延缓 OA 进程[3, 9-12]。然而，MSCs 体外扩增后容易发生衰老、终末分化等改变[2, 9]。同时还存在一定组织特异性问题，即 MSCs 再生及分化能力与其组织来源密切相关[3, 10]。比如，BMSCs 具有较强的自发成骨分化潜能，即使在体外成软骨诱导条件下，其合成的基质仍主要是Ⅰ型胶原，产生的是纤维软骨，而不是正常的透明软骨；而且 BMSCs 潜在的肥大分化能力在一定程度上可通过软骨内成骨途径诱导新生的纤维软骨组织钙化[13-14]。因此，非软骨来源 MSCs 在软骨损伤修复中的应用也存在一定局限性。近年在软骨组织中发现一类具有干细胞特性的软骨细胞亚群，为 OA 软骨损伤修复提供了新的种子细胞及干预靶点。
1.2 CPCs 的发现及特征
既往学者们认为成熟软骨细胞是关节软骨组织中唯一存在的细胞类型，但 Barbero 等[15]发现软骨来源细胞经单层培养扩增后，小部分细胞具有细胞克隆及三系分化（成骨、成软骨及成脂分化）能力。随后，多项研究证实关节软骨中确实存在一类具有自我增殖性、干细胞表面抗原表达特性及多向分化潜能的软骨细胞亚群，即 CPCs[7, 16-17]。CPCs 主要分散在软骨表层，表达 CD105、CD106、CD146、CD166、Notch-1、Integrin α5β1 及 SOX-9 等干细胞标志分子，不表达造血干细胞和白细胞特异标志分子 CD34 和 CD45[16, 18]，这些特征均符合国际细胞治疗协会（ISCT）2016 年定义的干细胞标准[19]，其中“CD105+/CD166+、CD34-、CD45-”组合已成为目前最常用的 CPCs 初步筛选及鉴定标准之一。
1.3 CPCs 在 OA 软骨损伤修复中的应用前景
Pretzel 等[20] 及 Alsalameh 等[21]均报道 OA 软骨细胞中 CPCs（CD105+/CD166+）比例略高于正常软骨细胞。Mazor 等[22]进一步报道轻度 OA 软骨细胞 CD105、CD166 和 SOX-9 mRNA 水平高于重度 OA 软骨细胞。Xia 等[23]也报道重度 OA 软骨组织中 CPCs 比例（10.61%±6.97%）明显低于正常软骨组织（18.44%±9.97%），提示 CPCs 与 OA 发生发展密切相关。Seol 等[24]采用荧光蛋白标记示踪技术发现软骨损伤可刺激 CPCs 归巢机制启动，通过诱导 CPCs 增殖分化实现受损部位细胞群恢复，可促进软骨损伤修复。McCarthy 等[25]发现 CPCs 多向分化能力和 BMSCs 相当，但自发成软骨分化能力及再生软骨组织功能优于 BMSCs。然而，Tao 等[26]报道在 OA 早期软骨损伤部位虽有一定数量的 CPCs 聚集，但其自主活化及成软骨分化能力并不能达到自主软骨完全修复的要求。因此，诱导活化 CPCs 是促进 OA 早期软骨损伤修复的潜在策略。
从自发成软骨分化能力及再生软骨组织功能上比较，CPCs 优于其他组织来源 MSCs（如 BMSCs、ADSCs、滑膜来源干细胞等），在 OA 早期内源性软骨损伤修复中更具优势[3]。然而，如果作为修复的种子细胞，目前大量获得 CPCs 的技术相对不成熟。根据现有文献报道结果，非软骨来源 MSCs 更具优势，尤其是 BMSCs 及 ADSCs，两者用于 OA 的研究相对较多且已有临床研究报道[27-29]。为解决 CPCs 来源问题，学者们进行了相关研究。Togo 等[30]研究发现兔耳软骨膜中存在大量 CPCs，其具有良好的三系分化能力，比软骨组织来源软骨细胞具有更好的增殖分化能力，将 CPCs 接种在胶原海绵支架上并植入裸鼠中，4 周后可产生与软骨细胞组相似质量、富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的软骨组织，而作为对照的 BMSCs 软骨组织生成能力明显弱于 CPCs。Takebe 等[31]进一步构建了旋转壁容器生物反应器，将耳软骨来源 CPCs 接种至 pC-HAp/ChS（由胶原、羟基磷灰石和硫酸软骨素组成的多孔材料）支架后，利用该反应器进行三维培养，成功构建出具有独特的人关节软骨特性的软骨组织。这些研究提示耳软骨来源 CPCs 是软骨修复重建种子细胞来源之一，但后续仍需对 CPCs 来源及应用进行深入探索研究。
2 miR-140 是 CPCs 的潜在诱导活化因子
2.1 miR-140 参与 OA 发病机制
正常情况下软骨组织保持合成与分解代谢平衡，并受环境、信号通路及 miRNA 等多种因素调节[8]。miRNA 是一类高度保守、长约 22 个碱基对的非编码小 RNA，可在细胞质内以完全或部分互补形式与靶基因 mRNA 3’端非翻译区（untranslated region，UTR）结合，引起靶基因 mRNA 降解或翻译抑制，调控哺乳动物约 1/3 的 mRNA 翻译，在细胞分化、增殖、衰老及凋亡等方面起重要调控作用[4, 32]。miR-140 基因位于大鼠 8 号染色体、人类 16 号染色体短臂上编码 E3 泛素蛋白连接酶基因 Wwp2 的 16 号与 17 号外显子之间，具有高度保守性，主要在软骨组织中表达，具有软骨特异性[4]，在软骨生长发育、稳态维持及损伤修复过程中起重要作用[33]。
既往研究已证实 miR-140 在人正常关节软骨中稳定表达[4]，其中多数研究发现 OA 软骨组织或细胞中 miR-140 表达较正常软骨组织或细胞减少[34-35]，但 Swingler 等[36]也报道 miR-140 在 OA 软骨中表达较正常软骨明显增高。这可能与实验样品来源不同有关，如人体不同关节软骨、不同小鼠、不同细胞系等都会对实验结果造成影响，不同的实验方法、体内和体外实验之间的差异也会影响结果。虽然 miR-140 在 OA 软骨中的表达变化规律目前尚存争议，但这些研究均证实 miR-140 在关节软骨发育、稳态及功能维持方面发挥着重要的调控作用。膝关节是 OA 最常累及的关节之一，目前膝关节来源软骨组织及细胞相关研究均报道 OA 组 miR-140 表达较正常组显著降低，学者们也检测了人膝 OA 关节软骨及关节液中 miR-140 表达水平，发现 OA 组 miR-140 表达较正常组显著下降，其水平与 OA 的严重程度成显著负相关[37]，而上调 miR-140 表达可部分抑制膝软骨组织和细胞 OA 样改变，延缓 OA 进程[38-41]，这也提示 miR-140 参与 OA 发病机制，而进一步研发基于 miR-140 的 OA 治疗策略具有重要意义。
2.2 miR-140 对 CPCs 的潜在诱导活化作用及机制
既往研究发现，成熟间充质谱系细胞（包括成熟软骨细胞）可以通过“去分化”重编程回到干细胞状态，并表现出高增殖能力和多向分化潜能[3, 15]。同时，自发性软骨损伤修复是 CPCs 及成熟软骨细胞共同作用的结果，两者之间可能存在重叠作用[3]。Hossein 等[42]发现 miR-140 可诱导 BMSCs 向软骨细胞分化，其诱导作用甚至强于目前经典的 TGF-β3 成软骨分化诱导法，但在软骨细胞中暂无相关研究报道。因此，后续验证 miR-140 是否可调控 CPCs 与成熟软骨细胞亚群重编程，将为 miR-140 促进软骨损伤修复提供更多证据。
既往研究已证实 MSCs 及 CPCs 均表达 Notch 信号通路相关分子，而激活 Notch 信号对 MSCs 成软骨分化具有明显抑制作用[25, 43]。Grogan 等[44]发现 Notch 下游产物 HES1 及 HEY1 可与 DNA 序列中 SOX-9 增强子识别位点相结合，抑制 SOX-9 介导的Ⅱ型胶原α1 链（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）的转录激活，从而抑制软骨细胞特异性 COL2A1 启动子的活动。生物信息学分析发现 JAG1、解聚蛋白样金属蛋白酶 10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）及 HEY1 等 Notch 信号通路关键信号分子基因 3’端 UTR 均存在 miR-140 结合靶点，而 JAG1 介导的 Notch 信号通路抑制 MSCs 向软骨细胞分化[45]。此外，Khayrullin 等[46]在肌萎缩症中也发现 miR-140 可调控 DNER、JAG1 及 HEY1 等 Notch 通路关键分子表达。这些研究均提示 miR-140 具有通过抑制 Notch 信号通路而诱导活化 CPCs、促进 OA 软骨损伤修复的潜力，后续有待进一步验证。
3 基于 CPCs 及 miR-140 的 OA 治疗策略
3.1 强调 OA 早期软骨损伤修复的重要性
正常情况下，关节软骨细胞属于静止类细胞，其合成与分解代谢处于动态平衡，这对关节软骨稳态及功能维持起着至关重要的作用[3]。在各种内源性或外源性有害因素（如衰老、炎症、创伤等）的刺激下，软骨细胞可一定程度发生代偿性改变，以维持软骨细胞及组织稳态；当刺激因素持续存在并超过细胞代偿能力时，细胞代谢平衡被打破，软骨细胞发生终末分化，细胞凋亡程序启动并产生多种有害物质[1]。正常关节软骨表面光滑，而在 OA 早期软骨表面出现小裂隙、裂缝及纤维化等改变，损伤仅累及软骨表层区域，软骨细胞凋亡少、ECM 降解程度轻，此时修复表层软骨损伤尚有延迟、预防，甚至逆转 OA 进展的可能[8]。随着 OA 进展，相关病理改变逐渐加重，尤其在 OA 晚期，软骨细胞大量死亡、ECM 广泛降解、软骨严重缺损伴软骨下骨硬化、暴露，同时伴随滑膜炎、骨赘形成等改变，此时软骨损伤修复或再生的可能性极小，软骨修复治疗意义已不大，相应治疗多局限于临床症状控制（如镇痛、骨骼肌松弛药物等）和人工关节置换手术（单髁置换术、人工全膝关节置换术）[47-48]。因此，结合 CPCs 主要分散在软骨表层的特点，强调 OA 早期干预具有重要临床意义。
3.2 miR-140 在 OA 早期干预中的作用及潜在机制
关节软骨损伤、稳态失衡是 OA 的主要特征之一，其中以Ⅱ型胶原和蛋白聚糖等 ECM 成分降解为主。既往研究已证实 miR-140 可直接调控基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、含血小板结合蛋白基序的 ADAMTS5、转录因子 Runx2 等多个基因，对软骨稳态起重要调控作用。MMP-13 及 ADAMTS5 是目前公认的最重要的两种软骨基质降解酶[49]，已证实 miR-140 可直接与 MMP-13 和 ADAMTS5 mRNA 3’端 UTR 位点结合，对其进行负调控[5, 50]。Runx2 是调控骨形成的主要转录因子之一，可通过诱导 MMP-13、Ⅹ型胶原及 ALP 等表达，进而促进软骨细胞终末分化及软骨内成骨过程，其在正常关节软骨细胞中几乎不表达，而在肥大软骨细胞中呈高表达[51-52]。Runx2 主要通过与 Smads 蛋白结合形成 Runx2-Smads 复合体起作用；Smad1 与 Smad3 竞争性结合 Runx2，前者激活 Runx2 活性，后者抑制 Runx2 活性[53-54]。Smad1、Smad3 分别是 BMP 和 TGF-β 信号通路关键信号分子[55]，目前已证实 BMP 通路受体 TGFBR1 是 miR-140 的直接作用靶点，上调 miR-140 可抑制 TGFBR1 及其下游 Smad1 的表达，Smad3 更多地结合 Runx2 并抑制其活性，这也提示 miR-140 可通过 TGF-β/BMP 通路调控软骨细胞稳态。
最近，Li 等[45]通过生物信息学手段预测出人 miR-140 存在 123 个潜在靶基因，通过基因功能富集分析发现，这些靶基因主要参与调节代谢进程、细胞交流、信号传导、化学刺激反应、干细胞增殖、细胞表面受体信号通路等生物过程，KEGG 通路分析发现 miR-140 的靶基因主要参与 Notch、TGF-β、PI3K/Akt、Hippo 等三十余条信号通路过程；进一步查阅文献发现，目前有 26 篇研究对 miR-140 靶点进行了报道，包含 23 个靶基因、涉及 7 条信号通路。因此，miR-140 在软骨细胞中可调控多个靶基因、参与多条信号通路、涉及多个生物过程，其在 OA 发病中的作用范围可能远超目前已发表文献报道的内容，值得进一步研究。
3.3 miR-140 在 OA 治疗中的应用策略
miR-140 是一种高度保守、主要在软骨组织中表达的非编码小 RNA，和其他 RNA 一样，其在体外及外周血中很容易降解，导致既往关于 miR-140 治疗 OA 的研究多集中在体外细胞或转基因动物中，这对后续探索 miR-140 治疗 OA 的指导作用有限。关节腔局部给药因其安全性获得广泛应用，是目前治疗 OA 的主要方式之一[38, 56-57]。有学者首次报道了关节腔注射 miR-140 可延缓大鼠 OA 进展[38]，但既往研究证实由于淋巴管及滑膜血管的作用，直接注射到关节内的药物或基因在关节液中清除速度快、停留时间短；同时，药物或基因在关节内的非靶向聚集也会降低软骨对它们的生物利用度，并加速从关节中清除，导致常常需要多次高剂量注射药物，而且操作繁琐、增加感染风险[58]。因此，为了增强 miR-140 软骨靶向递送效率及最小化药物剂量需求，构建具有良好安全性、软骨靶向性及高效递送 miR-140 的载体材料，对后续基于 miR-140 的 OA 治疗策略研发及临床转化具有重要意义。
目前已有研究报道多种 miRNA 递送载体，包括腺病毒、慢病毒、胶原蛋白支架、水凝胶等[57, 59-61]，进一步利用能选择性结合目标组织成分或具有生物功能的生化基团修饰，可提高载体材料的靶向性、药物递送效率及生物活性[56]。例如，Li 等[62]最近报道了 N-Cadherin 模拟肽修饰的自组装多肽纳米材料可增强 MSCs 的成软骨分化能力。软骨基质密集且呈高负电荷状态（主要源于蛋白多糖）是关节腔药物进入软骨组织的一大障碍。既往研究报道阳离子载体和带负电荷 ECM 之间的非特异性静电作用有利于药物快速渗透软骨，而且软骨基质高负电荷状态将大大增加阳离子载体的停留时间，从而使软骨从药物屏障转变成药物储存库[63]。目前已有研究报道阳离子纳米材料可通过静电作用高效递送表面呈负电荷的 miRNA[64]，选取合适的阳离子基团或分子修饰功能化载体材料不仅可作为软骨靶向、高效递送 miR-140 的载体，两者还可协同增强 OA 软骨损伤修复，具有良好的应用前景。
4 总结与展望
CPCs 与 OA 发生发展密切相关，虽然其具有良好的自我增殖性、干细胞表面抗原表达特性及多向分化潜能等特点，但其在 OA 软骨损伤部位自主活化及成软骨分化能力尚未达到软骨完全修复要求。miR-140 具有软骨特异性，以及抑制 Notch 信号通路、诱导活化 CPCs 并增强其增殖及成软骨分化的能力，从而促进 OA 软骨损伤修复的潜能。关节腔注射 miR-140 虽能在一定程度上延缓关节软骨退变，但也存在非靶向聚集、生物利用度低及清除快等问题，因此构建安全、软骨靶向且能高效递送 miR-140 的载体材料具有良好应用前景。此外，由于 CPCs 主要分散在软骨表层，而 OA 软骨损伤也开始于该层，因此强调 OA 早期干预至关重要。
综上述，miR-140 具有诱导活化 CPCs、促进 OA 早期软骨损伤修复的潜力，进一步探索 miR-140 在 OA 发生机制中的作用及研发基于 miR-140 新的 OA 治疗策略具有重要临床意义。