引用本文： 代志鹏, 郑稼, 高延征, 刘珂, 杨述华, 许伟华. 谷胱甘肽在激素诱导的 BMSCs 功能失调中的作用. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(1): 91-98. doi: 10.7507/1002-1892.201703129 复制
临床上糖皮质激素常用以治疗各种疾病，比如器官移植后的抗免疫排斥治疗、系统性红斑狼疮、风湿性疾病、哮喘等。然而大量使用激素的一个重要不良反应是导致股骨头坏死，故激素性股骨头坏死成为非创伤性股骨头坏死的重要类型。激素性股骨头坏死的发病机制尚不明确[1]，一般认为与骨细胞代谢平衡紊乱和凋亡密切相关[2]。近年来，诸多学者研究认为，激素诱导的 BMSCs 成骨、成脂分化异常，在股骨头坏死发病过程中起着重要作用[3-4]。我们前期研究也发现，激素性股骨头坏死来源的 BMSCs 成骨分化能力减弱，成脂分化能力增强，且激素可诱导细胞内活性氧水平升高[5]。研究表明[6]，使用激素后，机体的骨组织受到活性氧带来的氧化损伤，接受激素干预的小鼠体内可检测到 DNA 的氧化损伤。外源性氧化物可通过增强细胞内活性氧的水平诱导小鼠发生股骨头坏死[7]。这些研究表明氧化应激在股骨头坏死中起一定作用。
谷光甘肽（glutathione，GSH）是细胞内含有巯基的抗氧化剂，通过直接参与抗氧化酶的酶促反应，起到抗氧化、抗凋亡作用[8]。本实验选取人 BMSCs 为研究对象，在 BMSCs 体外培养过程中加入激素建立激素性股骨头坏死模型，采用不同浓度的 GSH 进行干预，检测细胞内活性氧水平的改变，同时检测 BMSCs 成骨分化相关基因和成脂分化相关基因的表达水平，探索细胞内活性氧水平对 BMSCs 成骨、成脂分化的影响，以及能否通过 GSH 降低细胞内活性氧的水平逆转分化的失衡，从而为治疗激素性股骨头坏死提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
人单核细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；兔抗人 Runx2 多克隆抗体、兔抗人过氧化物酶体增殖激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPAR-γ）多克隆抗体、兔抗人 CCAAT 增强结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding family of proteins，C/EBP）多克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；羊抗兔二抗 IgG（武汉博士德生物科技有限公司）；RT-PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）。
流式细胞仪（BD 公司，美国）；分光光度计（Millipore 公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；凝胶显像仪（北京六一仪器厂）。
1.2 标本获取及 BMSCs 分离培养
纳入标准：① 股骨颈骨折患者，均为头下型且 Garden Ⅳ型；② 年龄>65 岁；③ 需行髋关节置换手术。排除标准：① 长期吸烟；② 长期饮酒；③ 长期服用激素；④ 患有强直性脊柱炎或类风湿性疾病；⑤ 有脑卒中病史。经河南省人民医院伦理委员会批准和患者及家属书面同意，选取符合标准的 3 例股骨颈骨折患者，于髋关节置换术中，股骨扩髓时用预装有 2 mL 肝素的 50 mL 注射器抽取约 10 mL 骨髓，2 h 内对骨髓进行离心。
采用密度梯度离心联合贴壁法进行 BMSCs 的分离、培养和纯化。将细胞重悬于含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液，按 1.0×105个/mL 密度接种于 25 mL 培养瓶，置 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养；48 h 后更换培养液，弃非贴壁细胞，以后 3～4 d 换液 1 次；待贴壁细胞达 80%～90% 融合后，用 0.25% 胰蛋白酶–0.02%EDTA 消化；10%FBS 培养基中止消化，离心（1 000 r/min 离心 10 min）去除上清，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液悬浮，反复吹打后计数，以 1×104个/mL 密度传代接种于 25 mL 培养瓶，连续传代培养。经流式细胞术检测细胞表面抗原，证实培养细胞为 BMSCs。
1.3 实验分组
取第 3 代 BMSCs 分为 5 组：A 组，单纯 BMSCs 组（1×105个/mL）；B 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松；C 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+5 μmol/L GSH；D 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L GSH；E 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+50 μmol/L GSH。
1.4 观测指标
1.4.1 细胞内活性氧水平检测
培养 7 d，将待测细胞从培养瓶内消化、反复吹打、混匀，配成细胞悬液；细胞重悬于稀释的二氯荧光黄双乙酸盐，调整细胞密度为 2.0×106～2.0×107个/mL。于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育 20 min，每 5 分钟颠倒 1 次，使探针和细胞充分接触。利用流式细胞仪于发射波长 525 nm、激发波长 488 nm 条件下检测绿色荧光强度，根据阳性对照 Rosup 的荧光信号，检测出细胞内活性氧水平。
1.4.2 油红 O 染色观察
培养 21 d 取各组细胞，PBS 漂洗 3 次，加入 4% 多聚甲醛 2 mL 固定 30 min，加入预先配制好的油红 O 染液，静置染色 10 min，干燥，封片，倒置相差显微镜下观察细胞染色情况。于每孔加入 1 mL 异丙醇，利用异丙醇对着色油红 O 的激发作用，采用分光光度计在 490 nm 波长下检测每组吸光度（A）值。
1.4.3 RT-PCR 及实时荧光定量 PCR 检测
培养 7 d 取各组细胞，采用 RT-PCR 检测细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase）mRNA 表达水平。另外取各组细胞，用 Trizol 法提取 RNA，采用分光光度计检测 RNA 浓度，参照试剂盒设置反转录体系和定量 PCR 体系。参照 GeneBank 中基因 mRNA 序列的有效编码序列，通过 Primer Premier 5.0 软件设计引物。引物由美国 Invitrogen 公司上海分公司合成，引物序列见表 1。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、30 s，退火温度 55℃、30 s，72℃、1 min，45 个循环。以 β-actin 为内参，计算各目的基因相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 基因引物序列
Table1.
Primer sequences in real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 检测
培养 21 d 收集各组细胞，加入蛋白裂解液，充分混匀，分离总蛋白。利用分光光度计检测提取蛋白的浓度，用 Loading Buffer 调整蛋白浓度，并标记备用，上样电泳；电泳结束后，取出薄膜和凝胶；1% 脱脂奶粉封闭 1 h，预先将一抗（兔抗人 Runx2 多克隆抗体、兔抗人 PPAR-γ 多克隆抗体兔抗人 C/EBP 多克隆抗体、兔抗人 ALP 多克隆抗体）稀释为 1∶1 000，滴加至聚偏氟乙烯膜上，4℃ 冰箱内孵育过夜，加入二抗（羊抗兔二抗 IgG，1∶2 000），孵育 30 min。将显色液 ECL 滴加至聚偏氟乙烯膜上，3～5 min 后在凝胶显像仪上观察、拍照，分析各组条带亮度值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞内活性氧水平检测
培养 7 d，B 组细胞内活性氧水平显著高于其余各组，C 组高于 A、D、E 组，D、E 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
2.2 油红 O 染色观察
培养 21 d 倒置相差显微镜观察示，B 组油红 O 染色阳性细胞明显多于其余各组，C、D、E、A 组依次减少。各组 A 值比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.3 RT-PCR 检测及实时荧光定量 PCR 检测
培养 7 d RT-PCR 检测示，B 组 SOD 和 Catalase mRNA 相对表达量较其余各组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C 组较 B 组有所提高，但仍显著低于 A、D、E 组，D、E 组低于 A 组（P<0.05）； D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
实时荧光定量 PCR 检测示，B 组成脂转录因子 PPAR-γ 和 C/EBP mRNA 相对表达量较其余各组显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组较 B 组有所下降，但仍显著高于 A、D、E 组，D、E 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。B 组成骨转录因子 Runx2 和 ALP mRNA 相对表达量较其余各组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组较 B 组有所提高，但仍显著低于 A、D、E 组，D、E 组低于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
2.4 Western blot 检测
培养 21 d，B 组成脂转录因子 PPAR-γ 和 C/EBP 蛋白相对表达量较其余各组显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、A 组呈逐渐下降趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。B 组成骨转录因子 Runx2 和 ALP 蛋白相对表达量较其余各组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、A 组呈逐渐上升趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、6。
图1
培养 7 d 各组细胞内活性氧水平比较
Figure1.
Comparison of intracellular reactive oxygen species level between groups after cultured for 7 days
图2
培养 21 d 各组油红 O 染色观察
a～e. 分别为 A、B、C、D、E 组倒置相差显微镜下观察（×100）；f. 各组 A 值比较
Figure2. Oil red O staining of each group after cultured for 21 daysa-e. Inverted phase contrast microscope observation of groups A, B, C, and D respectively (×100); f. Comparison of A value of each group
图3
培养 7 d RT-PCR 检测各组 SOD 和 Catalase mRNA 相对表达量
a. SOD；b. Catalase
Figure3. Relative expressions of SOD and Catalase mRNA detected by RT-PCR after cultured for 7 daysa. SOD; b. Catalase
图4
培养 7 d 实时荧光定量 PCR 检测各组成脂和成骨转录因子 mRNA 相对表达量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure4. Relative expressions of adipogenic and osteogenic transcription factors mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCRa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
图5
培养 21 d Western blot 检测各组各蛋白表达电泳图
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：E 组
Figure5. Electrophoretic diagram of protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 days1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E
图6
培养 21 d Western blot 检测各组各蛋白相对表达量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure6. Relative protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 daysa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
3 讨论
本研究中，我们探索了抗氧化剂 GSH 对激素诱导的人 BMSCs 成脂、成骨分化的作用。在各组细胞培养 7 d 后，我们采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平，同时采用实时荧光定量 PCR 技术检测成脂和成骨特异性基因的表达水平。在细胞培养 21 d 对各组细胞进行油红 O 染色，检测成脂分化程度，同时利用 Western blot 技术检测相关基因蛋白表达水平，实验结果表明，一定浓度的激素可诱导 BMSCs 向脂肪细胞分化，在分化过程中活性氧起到促进成脂分化和抑制成骨分化的作用；外源性加入抗氧化物质，可以拮抗细胞内活性氧水平的增加，逆转了由激素诱导的抗氧化物酶 Catalase 和 SOD 的降低，恢复了细胞内正常氧化水平，改善了激素诱导的 BMSCs 成脂、成骨分化水平的改变。
BMSCs 来源于正常人的骨髓组织，是一类具有自我增殖和多向分化潜能的成体干细胞，在体外特定条件下可分化为多种中胚层细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞和上皮细胞[5]等。前期实验检测了所培养细胞的表面抗原和多向分化潜能，结果证实我们采用的 BMSCs 纯度较高，均一性较好。
GSH 是细胞内一种含有巯基的抗氧化剂，通过直接或间接参与抗氧化酶的酶促反应，起到抗氧化/抗凋亡作用[9]，因此，GSH 对维持细胞内稳定的活性氧水平起到重要作用，防止 DNA 损伤，延缓细胞衰老[10]。另外，GSH 还可与亲电子化合物结合从而发挥解毒抗氧化的作用。GSH 代谢产物中包含甘氨酸，甘氨酸可以起到稳定细胞膜的作用，因此外源的 GSH 可以抵抗细胞内异常增加的活性氧水平，还可以维持生物细胞膜的完整性，稳定细胞膜蛋白，减轻细胞损伤，促进修复[11]。Huang 等[12]研究通过杨梅苷干预 MC3T3 细胞系和 MSCs 增强 GSH 的活性，降低细胞内活性氧水平，可用于治疗骨代谢相关疾病。可见，GSH 在治疗骨相关疾病方面发挥着重要作用。
相关研究报道，激素可降低成骨细胞中Ⅰ型胶原和骨钙素基因的水平，诱导成骨细胞和骨细胞凋亡[13-14]。本研究结果表明，激素可以下调 Runx2 和 ALP 表达水平，同时上调 PPAR-γ 和 C/EBP 的表达。激素通过上调成脂转录因子促进 BMSCs 向脂肪细胞分化，下调成骨转录因子抑制其向成骨细胞分化，最终导致成骨、成脂分化失衡和骨丢失。因此，如果有一种药物能够促进骨的新生，同时抑制由激素诱导的成脂分化，或许能为由激素治疗带来的不良反应（如股骨头坏死）起到预防和控制作用。
Mody 等[15]研究发现，包括过氧化氢在内的诸多氧化剂可以明显抑制 MC3T-1 细胞系和骨髓间质细胞系 M2-10B4 成骨分化，而且抗氧化物质能逆转这种改变。Barbagallo 等[16]研究报道血红素氧合酶作为一种抗氧化物质，可明显促进人成骨干细胞的成骨分化。Cremers 等[17]研究发现，血红素氧合酶通过产生细胞保护分子（如铁/铁蛋白）降低细胞内氧化应激水平和炎性反应程度，减少脂肪来源 MSCs 的凋亡，同时也发现 N-乙酰半胱氨酸和 GSH 也有类似血红素氧合酶的作用。迄今为止，诸多学者通过向动物体内注入激素成功建立了激素型股骨头坏死动物模型，说明激素可诱导股骨头坏死形成。其中一个兔模型研究报道维生素 E 可对激素型股骨头坏死起到预防作用，这也说明了抗氧化物在预防股骨头坏死方面的重要作用[18]。本研究以激素作用下对 BMSCs 进行细胞培养，模拟激素性股骨头坏死细胞模型，选取氧化剂 GSH 进行干预，通过降低 BMSCs 内 ROS 的水平，从而逆转成骨、成脂分化程度，改善分化平衡。本实验中 GSH 设置了 5、10、50 μmol/L 3 个浓度组进行干预实验，结果发现在细胞培养 21 d，成脂分化水平均明显下降，且随着浓度增高，BMSCs 成脂分化水平逐渐下降，呈浓度依赖关系。本实验中，50 μmol/L GSH 效果最好。因此在一定浓度范围内，GSH 的浓度越高，对降低细胞内 ROS 的作用越强，降低成脂分化的效果越明显。
综上述，激素诱导 BMSCs 成脂分化增强、成骨分化减弱，是激素性股骨头坏死发病机制中的一个重要方面。我们首次提出 GSH 可作为抗氧化剂，通过抵抗 MSCs 内活性氧的水平治疗激素性股骨头坏死，而且在一定范围内，浓度越高，效果越明显。GSH 或其他抗氧化物可能成为有效预防或早期治疗激素性股骨头坏死的药物，为治疗股骨头坏死提供了一个理论依据。但本实验仍存在一些不足，比如 GSH 对人 BMSCs 功能的影响是在体外实验条件下完成的，缺乏体内实验证据，我们后续实验将进一步研究 GSH 在动物体内的作用。
临床上糖皮质激素常用以治疗各种疾病，比如器官移植后的抗免疫排斥治疗、系统性红斑狼疮、风湿性疾病、哮喘等。然而大量使用激素的一个重要不良反应是导致股骨头坏死，故激素性股骨头坏死成为非创伤性股骨头坏死的重要类型。激素性股骨头坏死的发病机制尚不明确[1]，一般认为与骨细胞代谢平衡紊乱和凋亡密切相关[2]。近年来，诸多学者研究认为，激素诱导的 BMSCs 成骨、成脂分化异常，在股骨头坏死发病过程中起着重要作用[3-4]。我们前期研究也发现，激素性股骨头坏死来源的 BMSCs 成骨分化能力减弱，成脂分化能力增强，且激素可诱导细胞内活性氧水平升高[5]。研究表明[6]，使用激素后，机体的骨组织受到活性氧带来的氧化损伤，接受激素干预的小鼠体内可检测到 DNA 的氧化损伤。外源性氧化物可通过增强细胞内活性氧的水平诱导小鼠发生股骨头坏死[7]。这些研究表明氧化应激在股骨头坏死中起一定作用。
谷光甘肽（glutathione，GSH）是细胞内含有巯基的抗氧化剂，通过直接参与抗氧化酶的酶促反应，起到抗氧化、抗凋亡作用[8]。本实验选取人 BMSCs 为研究对象，在 BMSCs 体外培养过程中加入激素建立激素性股骨头坏死模型，采用不同浓度的 GSH 进行干预，检测细胞内活性氧水平的改变，同时检测 BMSCs 成骨分化相关基因和成脂分化相关基因的表达水平，探索细胞内活性氧水平对 BMSCs 成骨、成脂分化的影响，以及能否通过 GSH 降低细胞内活性氧的水平逆转分化的失衡，从而为治疗激素性股骨头坏死提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
人单核细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；兔抗人 Runx2 多克隆抗体、兔抗人过氧化物酶体增殖激活受体 γ（peroxisome proliferator-activated receptors γ，PPAR-γ）多克隆抗体、兔抗人 CCAAT 增强结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding family of proteins，C/EBP）多克隆抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）；羊抗兔二抗 IgG（武汉博士德生物科技有限公司）；RT-PCR 试剂盒（Takara 公司，日本）。
流式细胞仪（BD 公司，美国）；分光光度计（Millipore 公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；凝胶显像仪（北京六一仪器厂）。
1.2 标本获取及 BMSCs 分离培养
纳入标准：① 股骨颈骨折患者，均为头下型且 Garden Ⅳ型；② 年龄>65 岁；③ 需行髋关节置换手术。排除标准：① 长期吸烟；② 长期饮酒；③ 长期服用激素；④ 患有强直性脊柱炎或类风湿性疾病；⑤ 有脑卒中病史。经河南省人民医院伦理委员会批准和患者及家属书面同意，选取符合标准的 3 例股骨颈骨折患者，于髋关节置换术中，股骨扩髓时用预装有 2 mL 肝素的 50 mL 注射器抽取约 10 mL 骨髓，2 h 内对骨髓进行离心。
采用密度梯度离心联合贴壁法进行 BMSCs 的分离、培养和纯化。将细胞重悬于含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液，按 1.0×105个/mL 密度接种于 25 mL 培养瓶，置 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养；48 h 后更换培养液，弃非贴壁细胞，以后 3～4 d 换液 1 次；待贴壁细胞达 80%～90% 融合后，用 0.25% 胰蛋白酶–0.02%EDTA 消化；10%FBS 培养基中止消化，离心（1 000 r/min 离心 10 min）去除上清，加入含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液悬浮，反复吹打后计数，以 1×104个/mL 密度传代接种于 25 mL 培养瓶，连续传代培养。经流式细胞术检测细胞表面抗原，证实培养细胞为 BMSCs。
1.3 实验分组
取第 3 代 BMSCs 分为 5 组：A 组，单纯 BMSCs 组（1×105个/mL）；B 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松；C 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+5 μmol/L GSH；D 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+10 μmol/L GSH；E 组，BMSCs（1×105个/mL）+10 μmol/L 地塞米松+50 μmol/L GSH。
1.4 观测指标
1.4.1 细胞内活性氧水平检测
培养 7 d，将待测细胞从培养瓶内消化、反复吹打、混匀，配成细胞悬液；细胞重悬于稀释的二氯荧光黄双乙酸盐，调整细胞密度为 2.0×106～2.0×107个/mL。于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育 20 min，每 5 分钟颠倒 1 次，使探针和细胞充分接触。利用流式细胞仪于发射波长 525 nm、激发波长 488 nm 条件下检测绿色荧光强度，根据阳性对照 Rosup 的荧光信号，检测出细胞内活性氧水平。
1.4.2 油红 O 染色观察
培养 21 d 取各组细胞，PBS 漂洗 3 次，加入 4% 多聚甲醛 2 mL 固定 30 min，加入预先配制好的油红 O 染液，静置染色 10 min，干燥，封片，倒置相差显微镜下观察细胞染色情况。于每孔加入 1 mL 异丙醇，利用异丙醇对着色油红 O 的激发作用，采用分光光度计在 490 nm 波长下检测每组吸光度（A）值。
1.4.3 RT-PCR 及实时荧光定量 PCR 检测
培养 7 d 取各组细胞，采用 RT-PCR 检测细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase）mRNA 表达水平。另外取各组细胞，用 Trizol 法提取 RNA，采用分光光度计检测 RNA 浓度，参照试剂盒设置反转录体系和定量 PCR 体系。参照 GeneBank 中基因 mRNA 序列的有效编码序列，通过 Primer Premier 5.0 软件设计引物。引物由美国 Invitrogen 公司上海分公司合成，引物序列见表 1。PCR 反应条件：94℃、2 min，94℃、30 s，退火温度 55℃、30 s，72℃、1 min，45 个循环。以 β-actin 为内参，计算各目的基因相对表达量。
表1
实时荧光定量 PCR 基因引物序列
Table1.
Primer sequences in real-time fluorescence quantitative PCR
1.4.4 Western blot 检测
培养 21 d 收集各组细胞，加入蛋白裂解液，充分混匀，分离总蛋白。利用分光光度计检测提取蛋白的浓度，用 Loading Buffer 调整蛋白浓度，并标记备用，上样电泳；电泳结束后，取出薄膜和凝胶；1% 脱脂奶粉封闭 1 h，预先将一抗（兔抗人 Runx2 多克隆抗体、兔抗人 PPAR-γ 多克隆抗体兔抗人 C/EBP 多克隆抗体、兔抗人 ALP 多克隆抗体）稀释为 1∶1 000，滴加至聚偏氟乙烯膜上，4℃ 冰箱内孵育过夜，加入二抗（羊抗兔二抗 IgG，1∶2 000），孵育 30 min。将显色液 ECL 滴加至聚偏氟乙烯膜上，3～5 min 后在凝胶显像仪上观察、拍照，分析各组条带亮度值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 细胞内活性氧水平检测
培养 7 d，B 组细胞内活性氧水平显著高于其余各组，C 组高于 A、D、E 组，D、E 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
2.2 油红 O 染色观察
培养 21 d 倒置相差显微镜观察示，B 组油红 O 染色阳性细胞明显多于其余各组，C、D、E、A 组依次减少。各组 A 值比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.3 RT-PCR 检测及实时荧光定量 PCR 检测
培养 7 d RT-PCR 检测示，B 组 SOD 和 Catalase mRNA 相对表达量较其余各组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C 组较 B 组有所提高，但仍显著低于 A、D、E 组，D、E 组低于 A 组（P<0.05）； D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
实时荧光定量 PCR 检测示，B 组成脂转录因子 PPAR-γ 和 C/EBP mRNA 相对表达量较其余各组显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组较 B 组有所下降，但仍显著高于 A、D、E 组，D、E 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。B 组成骨转录因子 Runx2 和 ALP mRNA 相对表达量较其余各组显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。C 组较 B 组有所提高，但仍显著低于 A、D、E 组，D、E 组低于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D、E 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
2.4 Western blot 检测
培养 21 d，B 组成脂转录因子 PPAR-γ 和 C/EBP 蛋白相对表达量较其余各组显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、A 组呈逐渐下降趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。B 组成骨转录因子 Runx2 和 ALP 蛋白相对表达量较其余各组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、A 组呈逐渐上升趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、6。
图1
培养 7 d 各组细胞内活性氧水平比较
Figure1.
Comparison of intracellular reactive oxygen species level between groups after cultured for 7 days
图2
培养 21 d 各组油红 O 染色观察
a～e. 分别为 A、B、C、D、E 组倒置相差显微镜下观察（×100）；f. 各组 A 值比较
Figure2. Oil red O staining of each group after cultured for 21 daysa-e. Inverted phase contrast microscope observation of groups A, B, C, and D respectively (×100); f. Comparison of A value of each group
图3
培养 7 d RT-PCR 检测各组 SOD 和 Catalase mRNA 相对表达量
a. SOD；b. Catalase
Figure3. Relative expressions of SOD and Catalase mRNA detected by RT-PCR after cultured for 7 daysa. SOD; b. Catalase
图4
培养 7 d 实时荧光定量 PCR 检测各组成脂和成骨转录因子 mRNA 相对表达量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure4. Relative expressions of adipogenic and osteogenic transcription factors mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCRa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
图5
培养 21 d Western blot 检测各组各蛋白表达电泳图
1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组 5：E 组
Figure5. Electrophoretic diagram of protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 days1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E
图6
培养 21 d Western blot 检测各组各蛋白相对表达量
a. PPAR-γ；b. C/EBP；c. Runx2；d. ALP
Figure6. Relative protein expressions of each group detected by Western blot after cultured for 21 daysa. PPAR-γ; b. C/EBP; c. Runx2; d. ALP
3 讨论
本研究中，我们探索了抗氧化剂 GSH 对激素诱导的人 BMSCs 成脂、成骨分化的作用。在各组细胞培养 7 d 后，我们采用流式细胞仪检测各组细胞内活性氧水平，同时采用实时荧光定量 PCR 技术检测成脂和成骨特异性基因的表达水平。在细胞培养 21 d 对各组细胞进行油红 O 染色，检测成脂分化程度，同时利用 Western blot 技术检测相关基因蛋白表达水平，实验结果表明，一定浓度的激素可诱导 BMSCs 向脂肪细胞分化，在分化过程中活性氧起到促进成脂分化和抑制成骨分化的作用；外源性加入抗氧化物质，可以拮抗细胞内活性氧水平的增加，逆转了由激素诱导的抗氧化物酶 Catalase 和 SOD 的降低，恢复了细胞内正常氧化水平，改善了激素诱导的 BMSCs 成脂、成骨分化水平的改变。
BMSCs 来源于正常人的骨髓组织，是一类具有自我增殖和多向分化潜能的成体干细胞，在体外特定条件下可分化为多种中胚层细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞和上皮细胞[5]等。前期实验检测了所培养细胞的表面抗原和多向分化潜能，结果证实我们采用的 BMSCs 纯度较高，均一性较好。
GSH 是细胞内一种含有巯基的抗氧化剂，通过直接或间接参与抗氧化酶的酶促反应，起到抗氧化/抗凋亡作用[9]，因此，GSH 对维持细胞内稳定的活性氧水平起到重要作用，防止 DNA 损伤，延缓细胞衰老[10]。另外，GSH 还可与亲电子化合物结合从而发挥解毒抗氧化的作用。GSH 代谢产物中包含甘氨酸，甘氨酸可以起到稳定细胞膜的作用，因此外源的 GSH 可以抵抗细胞内异常增加的活性氧水平，还可以维持生物细胞膜的完整性，稳定细胞膜蛋白，减轻细胞损伤，促进修复[11]。Huang 等[12]研究通过杨梅苷干预 MC3T3 细胞系和 MSCs 增强 GSH 的活性，降低细胞内活性氧水平，可用于治疗骨代谢相关疾病。可见，GSH 在治疗骨相关疾病方面发挥着重要作用。
相关研究报道，激素可降低成骨细胞中Ⅰ型胶原和骨钙素基因的水平，诱导成骨细胞和骨细胞凋亡[13-14]。本研究结果表明，激素可以下调 Runx2 和 ALP 表达水平，同时上调 PPAR-γ 和 C/EBP 的表达。激素通过上调成脂转录因子促进 BMSCs 向脂肪细胞分化，下调成骨转录因子抑制其向成骨细胞分化，最终导致成骨、成脂分化失衡和骨丢失。因此，如果有一种药物能够促进骨的新生，同时抑制由激素诱导的成脂分化，或许能为由激素治疗带来的不良反应（如股骨头坏死）起到预防和控制作用。
Mody 等[15]研究发现，包括过氧化氢在内的诸多氧化剂可以明显抑制 MC3T-1 细胞系和骨髓间质细胞系 M2-10B4 成骨分化，而且抗氧化物质能逆转这种改变。Barbagallo 等[16]研究报道血红素氧合酶作为一种抗氧化物质，可明显促进人成骨干细胞的成骨分化。Cremers 等[17]研究发现，血红素氧合酶通过产生细胞保护分子（如铁/铁蛋白）降低细胞内氧化应激水平和炎性反应程度，减少脂肪来源 MSCs 的凋亡，同时也发现 N-乙酰半胱氨酸和 GSH 也有类似血红素氧合酶的作用。迄今为止，诸多学者通过向动物体内注入激素成功建立了激素型股骨头坏死动物模型，说明激素可诱导股骨头坏死形成。其中一个兔模型研究报道维生素 E 可对激素型股骨头坏死起到预防作用，这也说明了抗氧化物在预防股骨头坏死方面的重要作用[18]。本研究以激素作用下对 BMSCs 进行细胞培养，模拟激素性股骨头坏死细胞模型，选取氧化剂 GSH 进行干预，通过降低 BMSCs 内 ROS 的水平，从而逆转成骨、成脂分化程度，改善分化平衡。本实验中 GSH 设置了 5、10、50 μmol/L 3 个浓度组进行干预实验，结果发现在细胞培养 21 d，成脂分化水平均明显下降，且随着浓度增高，BMSCs 成脂分化水平逐渐下降，呈浓度依赖关系。本实验中，50 μmol/L GSH 效果最好。因此在一定浓度范围内，GSH 的浓度越高，对降低细胞内 ROS 的作用越强，降低成脂分化的效果越明显。
综上述，激素诱导 BMSCs 成脂分化增强、成骨分化减弱，是激素性股骨头坏死发病机制中的一个重要方面。我们首次提出 GSH 可作为抗氧化剂，通过抵抗 MSCs 内活性氧的水平治疗激素性股骨头坏死，而且在一定范围内，浓度越高，效果越明显。GSH 或其他抗氧化物可能成为有效预防或早期治疗激素性股骨头坏死的药物，为治疗股骨头坏死提供了一个理论依据。但本实验仍存在一些不足，比如 GSH 对人 BMSCs 功能的影响是在体外实验条件下完成的，缺乏体内实验证据，我们后续实验将进一步研究 GSH 在动物体内的作用。
