引用本文： 任莉荣, 徐永清, 王海, 何晓清, 宋慕国, 陈学秋. 金黄色葡萄球菌肽聚糖对破骨细胞分化的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(8): 1006-1010. doi: 10.7507/1002-1892.20160203 复制
骨髓炎是一种急性或慢性骨组织感染，以化脓性炎症、异常骨重建、难控性骨吸收为特征[1]，常导致感染性骨不连，是骨科难治疾病之一。金黄色葡萄球菌是临床最常见的骨髓炎致病菌，但其引起感染性骨不连的机制目前尚未明了。金黄色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要毒力成分，研究表明其能激发机体炎性反应及免疫反应，导致化脓性关节炎[2]。但对于PGN-sa是否促进破骨细胞形成、导致骨溶解增加尚存在争议。本研究以不同浓度PGN-sa对raw264.7细胞进行诱导培养，以明确其是否具有促进破骨细胞分化形成的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
raw264.7细胞由昆明动物研究所提供。H-DMEM（HyClone公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美国）；NF-κB受体活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R & D Systems公司，美国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma公司，美国）。
酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；D90型倒置相差显微镜（南京江南光电股份有限公司）；Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；24孔COAS板（Life Sciences公司，美国）。
1.2 实验分组
根据培养条件不同，实验分为5组，分别为100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/ mL PGN-sa组、阳性对照组（100 ng/mL RANKL）以及空白对照组（PBS）。
1.3 观测指标
1.3.1 TRAP染色观察
将raw264.7细胞接种于96孔板，每孔5×103个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为5组，每组设5个复孔，分别加入对应浓度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天按TRAP试剂盒说明书进行染色。具体步骤：用丙酮、枸橼酸、甲醛混合制成的固定液，37℃固定细胞30 s；去离子水清洗3遍，加入TRAP染液，37℃避光染色1 h；去离子水清洗3遍，苏木素染色1 min；碱性自来水漂洗3～4遍。倒置相差显微镜下观察，细胞质内见酒石红色酸性磷酸酶活性颗粒为TRAP染色阳性细胞。将TRAP染色阳性且细胞核≥3个的细胞判断为破骨样细胞[3]，于200倍镜下计数每孔破骨样细胞。
1.3.2 骨吸收凹陷检测
将raw264.7细胞接种于24孔COAS板，每孔2×104个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为5组，每组设4个复孔，分别加入对应浓度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天吸弃培养基，PBS漂洗2遍，每孔加入5%次氯酸钠溶液1 mL，室温放置5 min，吸弃次氯酸钠溶液，去离子水漂洗培养板3遍，室温下放置4 h。光镜下观察骨吸收凹陷形成情况，于200倍镜下照相后，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量骨吸收凹陷面积，并计算每个视野下骨吸收凹陷面积与该视野面积的比值。
1.3.3 MTT检测
将raw264.7细胞接种于96孔板，每孔5×103个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为4组，分别为100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/ mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组及空白对照组，每组设10个复孔。按实验分组分别加入对应浓度PGN-sa及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天行MTT检测。具体步骤：每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL；避光条件下，于37℃细胞培养箱中继续培养4 h后，吸弃培养液；每孔加入150 μL DMSO，避光震荡10 min，于酶标仪检测波长570 nm处吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TRAP染色观察破骨样细胞形成情况
镜下见，除空白对照组外，各浓度PGN-sa组及阳性对照组均有破骨样细胞形成。见图 1。100 ng/ mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/ mL PGN-sa组以及阳性对照组、空白对照组破骨样细胞数分别为（107.54±13.23）、（226.77±8.11）、（297.85±9.01）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）个/孔。其中，各浓度PGN-sa组破骨样细胞数均高于空白对照组，但均低于阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；各浓度PGN-sa组破骨样细胞随PGN-sa浓度增加而增多，组间比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）。
图1
各组TRAP染色观察（倒置相差显微镜×200） ⓐ 100 ng/mL PGN-sa组 ⓑ 200 ng/mL PGN-sa组 ⓒ 400 ng/mL PGN-sa组 ⓓ 阳性对照组 ⓔ 空白对照组图 2各组骨吸收凹陷观察（×200） ⓐ 100 ng/mL PGN-sa组 ⓑ 200 ng/mL PGN-sa组 ⓒ 400 ng/mL PGN-sa组 ⓓ 阳性对照组 ⓔ 空白对照组
Figure1.
TRAP staining observation in every group (Inverted phase contrast microscopy× 200) ⓐ 100 ng/mL PGN-sa group ⓑ 200 ng/mL PGN-sa group ⓒ 400 ng/mL PGN-sa group ⓓ Positive control group ⓔ Blank control group Fig.2 Bone resorption observation in every group (×200) ⓐ 100 ng/mL PGN-sa group ⓑ 200 ng/mL PGN-sa group ⓒ 400 ng/mL PGN-sa group ⓓ Positive control grou ⓔ Blank control group
2.2 骨吸收凹陷检测
除空白对照组外，各浓度PGN-sa组及阳性对照组均见明显骨吸收凹陷形成。见图 2。100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组骨吸收凹陷面积比值分别为0.002 904±0.000 107、0.004 476±0.000 143、0.005 333±0.000 202，显著低于阳性对照组的0.009 595±0.001 017，高于空白对照组的0.000 167±0.000 122，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；各浓度PGN-sa组骨吸收凹陷面积比值随PGN-sa浓度增加也逐渐增大，组间比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 MTT检测
100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组A值分别为0.981±0.051、0.984±0.051、0.979±0.049，与空白对照组（0.986±0.047）比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；各浓度PGN-sa组间比较，差异亦无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
感染性骨不连是骨髓炎的治疗难点之一，随着骨科手术假体使用的增多及开放性骨折发生率的增加，感染性骨不连发生率也随之上升，据报道5%～10%的骨折会发展为骨不连[4]。此外，骨髓炎最为常见的致病菌金黄色葡萄球菌耐药性及侵袭性增加，使得骨髓炎治疗更困难[5-6]。目前，国内外学者主要从成骨分化[7]及骨形成方面[8-9]研究感染条件下感染性骨不连的发生机制，而致病菌对破骨细胞的分化形成及其对破骨细胞活性的影响方面研究较少。
金黄色葡萄球菌可产生多种细胞外及细胞相关的毒力因子，导致机体损伤[10]。PGN-sa是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要组成成分，本研究发现经PGN-sa培养后，raw264.7细胞在形态上形成了TRAP染色阳性且多核的破骨样细胞，破骨样细胞形成数目与PGN-sa浓度存在一定剂量关系；骨吸收凹陷实验可见骨吸收凹陷的形成，从功能上验证了所形成的破骨样细胞具有骨吸收活性，表明PGN-sa具有促进破骨细胞分化形成的作用。这一结果与Kishimoto等[11]及Kim等[12]的研究结果相同，但与Takami等[13]的研究结果存在不同之处，其研究得出PGN-sa抑制了所诱导的破骨细胞分化形成。究其原因，可能与所采用的破骨细胞前体细胞不同有关。Kobayashi等[14]用骨髓诱导方法，采用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及RANKL诱导骨髓远祖细胞获得破骨细胞前体细胞，由于实验开始于骨髓远祖细胞，破骨细胞前体细胞的形成率及细胞所处分化时期，明显受M-CSF及RANKL的浓度及作用时间影响，而且诱导获得的破骨细胞前体细胞为多种细胞的混合体，对观测结果产生一定影响。而本研究采用已成系的破骨细胞前体细胞raw264.7[15]，该细胞株处于分化晚期[16]，采用RANKL即可促进其分化形成成熟的破骨细胞[17]，甚至在无RANKL的情况下，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α等也可诱导其分化为成熟的破骨细胞[18]。因此本实验选择raw264.7细胞作为研究对象，使结果更可靠。
此外，在体外实验方面，有学者对金黄色葡萄球菌及其表面相关蛋白及物质进行研究，发现其能诱导破骨细胞分化形成及激活[19-20]。Kim等[12]的研究也发现，细菌脂类蛋白通过诱导破骨细胞分化形成及激活，进而在骨破坏过程中起重要作用。在体内实验方面，Liu等[2]将PGN-sa注射至小鼠关节内，发现其引起了化脓性关节炎及骨、软骨的破坏。本研究发现PGN-sa能促进破骨细胞的分化形成，与上述研究结果一致。但是，PGN-sa虽然为金黄色葡萄球菌细胞壁上一毒性因子，在本研究实验浓度下，其对raw264.7细胞的增殖活性无显著影响，提示在慢性低毒性感染条件下，PGN-sa更多的体现其免疫原性而非毒性。但PGN-sa只是金黄色葡萄球菌众多毒性因子的一部分，在感染情况下金黄色葡萄球菌作为一种活菌，除了细胞壁的毒性因子外，还能合成分泌一些毒性因子，其作为一个整体对破骨细胞的诱导分化作用需要进一步研究及验证，而PGN-sa通过何种信号通路促进破骨细胞分化也需进一步研究。
综上述，体外实验提示PGN-sa可促进破骨细胞的分化形成，而破骨细胞分化形成的增多，可导致溶骨活性的增强，进而成为感染性骨不连的一个重要原因。由此也提示，金黄色葡萄球菌骨髓炎中感染性骨不连的成因，除了感染导致的成骨不全外，还存在感染导致的破骨活性增加。因此，从成骨不全及破骨增加两方面，对感染性骨不连进行深入研究，探讨其机制，有望对骨髓炎的治疗提供理论依据及策略。
骨髓炎是一种急性或慢性骨组织感染，以化脓性炎症、异常骨重建、难控性骨吸收为特征[1]，常导致感染性骨不连，是骨科难治疾病之一。金黄色葡萄球菌是临床最常见的骨髓炎致病菌，但其引起感染性骨不连的机制目前尚未明了。金黄色葡萄球菌肽聚糖（Staphylococcal peptidoglycan，PGN-sa）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要毒力成分，研究表明其能激发机体炎性反应及免疫反应，导致化脓性关节炎[2]。但对于PGN-sa是否促进破骨细胞形成、导致骨溶解增加尚存在争议。本研究以不同浓度PGN-sa对raw264.7细胞进行诱导培养，以明确其是否具有促进破骨细胞分化形成的作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
raw264.7细胞由昆明动物研究所提供。H-DMEM（HyClone公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；PGN-sa（Invitrogen公司，美国）；NF-κB受体活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R & D Systems公司，美国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma公司，美国）。
酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；D90型倒置相差显微镜（南京江南光电股份有限公司）；Image-Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；24孔COAS板（Life Sciences公司，美国）。
1.2 实验分组
根据培养条件不同，实验分为5组，分别为100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/ mL PGN-sa组、阳性对照组（100 ng/mL RANKL）以及空白对照组（PBS）。
1.3 观测指标
1.3.1 TRAP染色观察
将raw264.7细胞接种于96孔板，每孔5×103个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为5组，每组设5个复孔，分别加入对应浓度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天按TRAP试剂盒说明书进行染色。具体步骤：用丙酮、枸橼酸、甲醛混合制成的固定液，37℃固定细胞30 s；去离子水清洗3遍，加入TRAP染液，37℃避光染色1 h；去离子水清洗3遍，苏木素染色1 min；碱性自来水漂洗3～4遍。倒置相差显微镜下观察，细胞质内见酒石红色酸性磷酸酶活性颗粒为TRAP染色阳性细胞。将TRAP染色阳性且细胞核≥3个的细胞判断为破骨样细胞[3]，于200倍镜下计数每孔破骨样细胞。
1.3.2 骨吸收凹陷检测
将raw264.7细胞接种于24孔COAS板，每孔2×104个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为5组，每组设4个复孔，分别加入对应浓度的PGN-sa、RANKL及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天吸弃培养基，PBS漂洗2遍，每孔加入5%次氯酸钠溶液1 mL，室温放置5 min，吸弃次氯酸钠溶液，去离子水漂洗培养板3遍，室温下放置4 h。光镜下观察骨吸收凹陷形成情况，于200倍镜下照相后，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量骨吸收凹陷面积，并计算每个视野下骨吸收凹陷面积与该视野面积的比值。
1.3.3 MTT检测
将raw264.7细胞接种于96孔板，每孔5×103个，加入含15%FBS及1%青、链霉素的H-DMEM培养基培养24 h后，更换培养基。将细胞分为4组，分别为100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/ mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组及空白对照组，每组设10个复孔。按实验分组分别加入对应浓度PGN-sa及PBS，每3天换液1次。于添加处理因素后第5天行MTT检测。具体步骤：每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT 20 μL；避光条件下，于37℃细胞培养箱中继续培养4 h后，吸弃培养液；每孔加入150 μL DMSO，避光震荡10 min，于酶标仪检测波长570 nm处吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TRAP染色观察破骨样细胞形成情况
镜下见，除空白对照组外，各浓度PGN-sa组及阳性对照组均有破骨样细胞形成。见图 1。100 ng/ mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/ mL PGN-sa组以及阳性对照组、空白对照组破骨样细胞数分别为（107.54±13.23）、（226.77±8.11）、（297.85±9.01）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）个/孔。其中，各浓度PGN-sa组破骨样细胞数均高于空白对照组，但均低于阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；各浓度PGN-sa组破骨样细胞随PGN-sa浓度增加而增多，组间比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）。
图1
各组TRAP染色观察（倒置相差显微镜×200） ⓐ 100 ng/mL PGN-sa组 ⓑ 200 ng/mL PGN-sa组 ⓒ 400 ng/mL PGN-sa组 ⓓ 阳性对照组 ⓔ 空白对照组图 2各组骨吸收凹陷观察（×200） ⓐ 100 ng/mL PGN-sa组 ⓑ 200 ng/mL PGN-sa组 ⓒ 400 ng/mL PGN-sa组 ⓓ 阳性对照组 ⓔ 空白对照组
Figure1.
TRAP staining observation in every group (Inverted phase contrast microscopy× 200) ⓐ 100 ng/mL PGN-sa group ⓑ 200 ng/mL PGN-sa group ⓒ 400 ng/mL PGN-sa group ⓓ Positive control group ⓔ Blank control group Fig.2 Bone resorption observation in every group (×200) ⓐ 100 ng/mL PGN-sa group ⓑ 200 ng/mL PGN-sa group ⓒ 400 ng/mL PGN-sa group ⓓ Positive control grou ⓔ Blank control group
2.2 骨吸收凹陷检测
除空白对照组外，各浓度PGN-sa组及阳性对照组均见明显骨吸收凹陷形成。见图 2。100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组骨吸收凹陷面积比值分别为0.002 904±0.000 107、0.004 476±0.000 143、0.005 333±0.000 202，显著低于阳性对照组的0.009 595±0.001 017，高于空白对照组的0.000 167±0.000 122，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；各浓度PGN-sa组骨吸收凹陷面积比值随PGN-sa浓度增加也逐渐增大，组间比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 MTT检测
100 ng/mL PGN-sa组、200 ng/mL PGN-sa组、400 ng/mL PGN-sa组A值分别为0.981±0.051、0.984±0.051、0.979±0.049，与空白对照组（0.986±0.047）比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；各浓度PGN-sa组间比较，差异亦无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
感染性骨不连是骨髓炎的治疗难点之一，随着骨科手术假体使用的增多及开放性骨折发生率的增加，感染性骨不连发生率也随之上升，据报道5%～10%的骨折会发展为骨不连[4]。此外，骨髓炎最为常见的致病菌金黄色葡萄球菌耐药性及侵袭性增加，使得骨髓炎治疗更困难[5-6]。目前，国内外学者主要从成骨分化[7]及骨形成方面[8-9]研究感染条件下感染性骨不连的发生机制，而致病菌对破骨细胞的分化形成及其对破骨细胞活性的影响方面研究较少。
金黄色葡萄球菌可产生多种细胞外及细胞相关的毒力因子，导致机体损伤[10]。PGN-sa是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要组成成分，本研究发现经PGN-sa培养后，raw264.7细胞在形态上形成了TRAP染色阳性且多核的破骨样细胞，破骨样细胞形成数目与PGN-sa浓度存在一定剂量关系；骨吸收凹陷实验可见骨吸收凹陷的形成，从功能上验证了所形成的破骨样细胞具有骨吸收活性，表明PGN-sa具有促进破骨细胞分化形成的作用。这一结果与Kishimoto等[11]及Kim等[12]的研究结果相同，但与Takami等[13]的研究结果存在不同之处，其研究得出PGN-sa抑制了所诱导的破骨细胞分化形成。究其原因，可能与所采用的破骨细胞前体细胞不同有关。Kobayashi等[14]用骨髓诱导方法，采用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及RANKL诱导骨髓远祖细胞获得破骨细胞前体细胞，由于实验开始于骨髓远祖细胞，破骨细胞前体细胞的形成率及细胞所处分化时期，明显受M-CSF及RANKL的浓度及作用时间影响，而且诱导获得的破骨细胞前体细胞为多种细胞的混合体，对观测结果产生一定影响。而本研究采用已成系的破骨细胞前体细胞raw264.7[15]，该细胞株处于分化晚期[16]，采用RANKL即可促进其分化形成成熟的破骨细胞[17]，甚至在无RANKL的情况下，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α等也可诱导其分化为成熟的破骨细胞[18]。因此本实验选择raw264.7细胞作为研究对象，使结果更可靠。
此外，在体外实验方面，有学者对金黄色葡萄球菌及其表面相关蛋白及物质进行研究，发现其能诱导破骨细胞分化形成及激活[19-20]。Kim等[12]的研究也发现，细菌脂类蛋白通过诱导破骨细胞分化形成及激活，进而在骨破坏过程中起重要作用。在体内实验方面，Liu等[2]将PGN-sa注射至小鼠关节内，发现其引起了化脓性关节炎及骨、软骨的破坏。本研究发现PGN-sa能促进破骨细胞的分化形成，与上述研究结果一致。但是，PGN-sa虽然为金黄色葡萄球菌细胞壁上一毒性因子，在本研究实验浓度下，其对raw264.7细胞的增殖活性无显著影响，提示在慢性低毒性感染条件下，PGN-sa更多的体现其免疫原性而非毒性。但PGN-sa只是金黄色葡萄球菌众多毒性因子的一部分，在感染情况下金黄色葡萄球菌作为一种活菌，除了细胞壁的毒性因子外，还能合成分泌一些毒性因子，其作为一个整体对破骨细胞的诱导分化作用需要进一步研究及验证，而PGN-sa通过何种信号通路促进破骨细胞分化也需进一步研究。
综上述，体外实验提示PGN-sa可促进破骨细胞的分化形成，而破骨细胞分化形成的增多，可导致溶骨活性的增强，进而成为感染性骨不连的一个重要原因。由此也提示，金黄色葡萄球菌骨髓炎中感染性骨不连的成因，除了感染导致的成骨不全外，还存在感染导致的破骨活性增加。因此，从成骨不全及破骨增加两方面，对感染性骨不连进行深入研究，探讨其机制，有望对骨髓炎的治疗提供理论依据及策略。
