下肢截肢是对身体结构的显著改变，肌肉、血管及血液的损失会导致血流的重新分布和血管末端阻力的变化。针对下肢截肢后心血管疾病患病率显著增高但其机制尚不清楚等问题，本文旨在建立一个可验证和探索截肢对心血管系统影响的动物研究模型，并为后续探究不同截肢水平对心血管系统影响的动物实验提供模型和方法。选用无特定病原体（SPF）新西兰兔并分为正常组（n = 6）和截肢组（n = 6），其中截肢组作膝上截肢处理，术后定期监测实验兔血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）等含量的变化，并取材做动脉病理检测。结果表明，与正常组相比，截肢组血清LDL-C和TC含量均显著增加（P <0.05）；血管出现了中膜层平滑肌细胞变性坏死、弹性纤维断裂等病理改变；腹主动脉和主动脉弓的弹性纤维面积表达百分比（EFEP）较正常组有明显下降。以上结果提示，兔的心血管系统在截肢术后有动脉弹性降低、血液中脂质沉积等病变的趋势，标志着成功地建立了关于截肢对心血管系统影响的动物实验模型，为进一步研究截肢影响心血管系统的机制提供了实验平台。
引用本文： 闵磊, 蒋文涛, 李忠友, 李潇, 魏君如, 刁珺杰, 白逃萍, 晏菲. 研究截肢对心血管系统影响的动物模型建立. 生物医学工程学杂志, 2022, 39(5): 991-996. doi: 10.7507/1001-5515.202203064 复制
引言
截肢术是指经关节或骨头将已丧失生存能力、危害患者生命或已丧失生理功能的肢体切除的破坏性外科手术，行截肢术后患者将失去部分肌肉组织及血液循环系统。而据英国研究机构对战后残疾军人的健康调查发现，下肢截肢军人心血管疾病的发病率远高于其他军人［包括心肌梗死（42%[1]、19.8%[2]）、高血压（43.6%[3]、42.7%[4]）、高胆固醇（38.9%[5]）、高血脂（37.6%[4]）、冠脉粥样硬化（12.4%[6]）、主动脉瘤（5.8%[7]）、外周血管疾病（5%[4]）等］，特别是非创伤性下肢截肢者尤为明显。已有研究表明，心血管疾病的形成与血流速度、血压、血管壁面剪切应力等血流动力学参数密切相关[8-10]，而截肢导致的人体血管和肌肉组织的丢失，会引起血流的重新分布和血管末端阻力的变化[11]，进而影响人体的血流动力学分布。因此，截肢是否会对人体心血管系统产生影响自然成为一个值得深入研究的课题。
目前基于血流动力学的心血管系统研究通常采用计算流体力学方法结合血管成像技术，如计算机断层扫描（computed tomography，CT）成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、超声（ultrasound，US）成像和数字减影图像等，以及三维重建技术进行数值模拟，虽然可以细致地获得心血管系统内的血流动力学分布规律，但仍需再结合体外实验、动物实验或临床试验等进行验证或开展更深入的心血管疾病发生发展规律和机制等方面的研究。其中，动物实验被认为是心血管疾病研究从实验室走向临床治疗中不可缺少的关键环节[12]。建立和使用合适的动物模型对动物实验结果的合理性以及相关基础研究和诊疗工具的发展具有重要的作用[13]，如遗传性高血脂家兔（Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit，WHHL）模型被证明是最适合研究动脉粥样硬化的动物模型[14-15]，大鼠冠状动脉结扎模型常用于研究心肌梗死[16-17]，而自发性高血压大鼠模型则适用于研究先天性高血压[18]。
因此，在针对前述截肢与心血管系统关系的研究中，采用动物实验验证和探索截肢能否对心血管系统产生影响是十分必要的。如何建立动物模型、利用哪些指标监测心血管系统变化等是首先需要解决的问题。虽然已有研究采用截肢动物研究截肢过程中动物心脏功能的变化[19]（术后即处死实验动物），但就截肢对于动物心血管系统的长期影响还未见相应的研究模型。
为此，本文选择兔作为实验对象，截肢并行肌肉成形术，通过监测总胆固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）等生化指标及动脉病理检测［苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、范基林（van Gieson，VG）染色］来获取兔心血管系统的改变，以期建立一种成活率高、稳定性好、便于监测的动物实验模型，为后续进一步深入研究截肢对心血管系统的影响提供动物实验平台。
1 材料与方法
本文的动物实验研究主要分为三个阶段：截肢手术、动物生化指标检测以及动物病理组织检测。
1.1 实验动物选择
选择合适的动物品种对于能否成功造模非常重要。常规动物实验通常选择大鼠、小鼠、猪、狗、兔等作为研究对象，其中猪[20]和兔[21]是两种心血管系统与人类最为相似的动物，但考虑到动物模型的制作难度及取材的便利性，实验兔模型具有造模时间短而且成本低的特点，因此本文选择兔作为实验动物研究对象。
实验室环境下兔子的平均寿命为10年[22]，针对成年期这一阶段，对于实验兔来说，18.25天的时间相当于人类寿命的一年（365天）[23]，因此本文进行合理假设，将实验兔截肢术后7天、14天、60天的心血管系统变化类比人类截肢后约18周、36周、3年的心血管系统变化。
本实验选用健康活力好、无运动障碍、无皮肤病的无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）新西兰兔［SCXK（川）2019-031］，体重（2.2 ± 0.31）kg，购自成都达硕实验动物有限公司。动物的饲养及实验过程依照《成都市实验动物管理条例》相关规定进行，经四川大学医学伦理委员会批准通过。
1.2 截肢手术
截肢方法采用已在临床广泛使用的肌肉成形术，可以减少截肢手术过程对实验兔血液循环系统的影响。
实验兔共12只，分为正常组（n = 6）和截肢组（n = 6），均在动物笼中单笼饲养（如图1a所示）。两组实验兔在笼中均可自由活动、进食和饮水，室温控制在25 ℃左右，12 h光照与黑暗循环交替。经过7天的适应期喂养后，对截肢组实施手术。用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规剪毛后依次切开皮肤，分离肌层、浅深筋膜，游离血管、神经并于近心端结扎，膝关节以上股骨远端用手术钳夹断，依次切断肌肉、血管及神经，保留足够的肌肉长度（截断位置向前5 cm处），将肌肉缝合包住股骨（如图1b所示）。术后将实验兔放于加热板上，待状态稳定后，送入原来的动物笼中。术后连续三天为截肢组注射抗生素（青霉素11 000～22 000 U/kg，肌肉注射），以避免截肢组实验兔因伤口感染死亡。
图1
实验动物及截肢手术
a. 单笼饲养实验兔的生活环境；b. 实验兔膝上截肢手术
Figure1. Experimental animals and amputationa. the living environment of experimental rabbits; b. lower limb amputation
1.3 血液生化检查
临床通常采用LDL-C和TC[24]等指标进行心血管疾病的初筛。TC水平与较高的心血管疾病死亡率相关[25-27]；LDL-C与冠心病风险呈正相关，与动脉粥样硬化[28]之间存在剂量依赖关系。因此，TC和LDL-C升高被普遍认为是心血管疾病的主要危险因素[29]，而它们同样可以作为实验兔心血管系统发生变化的参照[30-31]。故本文采用兽用生化分析仪（BS-240VET，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）对兔血清中的TC及LDL-C含量进行检测。
1.4 组织病理切片检查
为与生化指标结果相结合进一步验证实验兔心血管系统的变化，饲养期结束后，开展动物模型的组织病理检测工作。在兔体内，动脉粥样硬化病变主要分布在主动脉弓、胸主动脉、肋间动脉起源处[21]，故取股动脉、主动脉弓、腹主动脉、胸主动脉作病理切片检查（HE染色），同时进行VG染色以标明血管中的肌纤维（呈黄色）、胶原纤维（呈红色）和弹力纤维（呈黑色）。另取实验动物的心、肝、脾、肺、肾做基础疾病分析，排除实验动物本身疾病对于心血管系统的影响。解剖之后取材制标本，并按病理检验SOP程序进行。采用数字切片扫描仪（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）对切片进行观察和图像采集。VG染色后，每张切片先于40倍镜下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域放大400倍采集图像。HE染色后，每张切片先于40倍镜下观察全部组织，察看大体病变情况，再选择要观察的区域采集放大100倍和400倍的图片，观察具体病变。
1.5 统计分析
所有数据均用SPSS 26.0软件进行统计分析。所有数据表示为均值±标准差。采用单因素方差分析比较正常组和截肢组血清中的LDL-C及TC含量。所有的统计分析中，检验水准均为0.05。
2 结果
术后实验兔存活良好，进食进水无异常，且能够在缺损肢体的情况下进行正常活动。动物模型的存活意味着造模成功，是实验后续开展的基础。
行截肢术后，各组实验兔血清中的LDL-C含量、TC含量如图2所示。截肢组LDL-C含量、TC含量与正常组的差异有统计学意义（P<0.05），说明截肢组这两项危险指标在术后发生显著变化。
图2
LDL-C含量、TC含量对比图
*
*
VG染色观察弹性纤维的形态及变化情况如图3所示，动脉血管中层弹力膜呈黑色波浪线型，由内向外层状排列。定性比较发现，正常组实验兔弹性纤维层总体厚度宽于截肢组。因实验兔本身体重有差异导致内脏大小不完全相同，故采用弹性纤维面积表达百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）作为动脉病变程度的指标更为合理。正常组主动脉弓及腹主动脉处的EFEP分别为20.69%和13.26%，截肢组分别为11.28%和7.8%。
图3
术后60天截肢组主动脉弓及腹主动脉VG染色图像
弹性纤维由图中黄色箭头标示
Figure3. Van Gieson stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationelastic fibers are indicated by yellow arrows in the figures
主动脉弓及腹主动脉的HE染色结果如图4所示，在光镜观察下，本实验部分动脉出现内膜层内皮细胞脱落、中膜层平滑肌细胞变性坏死、弹性纤维断裂、黏液样物质沉积和管腔内红细胞蓄积等病理改变。
图4
术后60天截肢组主动脉弓及腹主动脉HE染色图像
中膜层平滑肌细胞变性坏死由绿色箭头标示，弹性纤维断裂由黑色箭头标示，黏液样物质沉积由蓝色箭头标示
Figure4. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationdegeneration and necrosis of smooth muscle cells in the middle membrane are marked by green arrows, elastic fiber breakage is marked by black arrow, and myxoid deposition is marked by blue arrow
3 讨论
本文选用兔作为实验动物是基于兔子与人心血管系统的相似性[32]，与啮齿类动物相比，兔子在进化上更接近灵长类动物[13]，特别是家兔的脂蛋白谱及对胆固醇的敏感性与人类完全相同，使得兔动脉粥样硬化的病理演化过程中，从早期到晚期病变都与人类相似[33]。
血液中TC含量作为心血管系统发生病变的重要因素[30]，与较高的心血管疾病死亡率相关[25-27]，实验兔在截肢术后TC含量急剧升高，说明截肢术后实验兔的心血管系统有脂质沉积等病变的趋势。正常状态下，TC含量中的50% ～ 60%由LDL-C组成[34]，占比最大，故血液中的LDL-C含量变化将直接影响TC含量。相比正常组，截肢组血清中LDL-C含量显著增高，说明其TC含量升高的主要原因是LDL-C含量的变化。而LDL-C含量的增大会引起泡沫细胞的形成及增殖，后者刺激血管平滑肌细胞及纤维组织增生，以致粥样斑块形成并导致动脉粥样硬化[35-36]和冠心病[37-38]等心血管疾病的发生。常用的心血管疾病动物模型WHHL兔[15]则因缺少LDL-C受体而极易患动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病，表明LDL-C含量的升高会使实验兔有患心血管疾病的趋势。结合前述中TC作为心血管系统发生病变的主要因素，术后截肢组血清中TC和LDL-C含量显著高于正常组的这一现象，表明截肢组患心血管疾病的风险增大。
生化检测结果初步预测实验兔的心血管系统发生了病变，而动脉病理检测结果则证实了这一预测。实验兔动脉的VG染色结果显示，截肢组主动脉弓和腹主动脉切片的EFEP与正常组相比明显下降（腹主动脉：7.8%比13.26%；主动脉弓：11.28%比20.69%），表明截肢术后兔的动脉弹性变小。动脉弹性功能不仅是收缩压、舒张压、脉压等血流动力学参数的重要决定因素, 而且反映了动脉内皮功能状况[39]。同时，动脉弹性功能的减退也是心血管疾病危险因素的重要标志[40]。而HE染色结果显示，截肢组术后动脉发生了弹力纤维断裂、平滑肌细胞坏死、黏液物质沉积等病理现象，说明在动脉弹性发生变化的基础上，截肢组发生了心血管系统病变，标志着该动物模型的成功建立。
因兔腿部的骨骼和肌肉结构与人相似，本文采用适用于人体的肌肉成形术进行动物造模，术后各组实验兔存活良好，表明该方法完全适用于动物截肢，并且能够有效防止术后实验兔因运动造成伤口的裂开及断骨露出。术后对实验兔心血管系统的动态监测，是通过采血进行生化检测来实现，在采血周期为一周的前提下几近于无创检测，对动物模型没有本质上的影响，方便快捷，安全性高。另外，动物的饲养环节也非常简便，只需定期给予动物水和饲料（无高胆固醇物质）即可。从经济层面讲，该方法成本较低，便于大规模地制作动物模型以开展研究。
4 结论
本文对截肢兔进行长时间的喂养，期间监测实验兔的生理指标，实验结束后对实验兔进行组织病理检测，结果显示截肢术后兔的心血管系统发生了病变且病变程度随时间增长进一步加重，标志着成功地建立了关于截肢对心血管影响研究的动物模型，为研究截肢对心血管系统的影响提供了一种方法，也为后续深入研究截肢后心血管疾病的发生机制、不同截肢水平对心血管系统的影响程度提供了经济适用的动物实验平台。同时，该动物模型同样可以投喂特定的药物或者特种饲料来建立特定心血管疾病的动物模型，可用于指导截肢患者的饮食及用药，以防患者因饮食习惯或不当用药引起或加重自身的心血管疾病。本文的实验方法仍然存在可以改进的地方，如是否需要对正常组进行“假手术”以防动物心理对实验结果产生影响。另外，在本实验基础上进一步提高动物的存活率、将该动物模型的造模方法应用于其他动物等仍需进一步的研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：蒋文涛主要负责项目主持、实验设计以及论文审阅修订；闵磊主要负责动物实验方案的制定及实施、实验数据分析及论文编写；李忠友主要负责数据分析指导以及论文修订；李潇、魏君如、刁珺杰参与结果讨论及论文修订；白逃萍和晏菲主要负责实验方案设计指导。
伦理声明：本实验通过了四川大学医学伦理委员会的审批（批文编号：K2022002）。
引言
截肢术是指经关节或骨头将已丧失生存能力、危害患者生命或已丧失生理功能的肢体切除的破坏性外科手术，行截肢术后患者将失去部分肌肉组织及血液循环系统。而据英国研究机构对战后残疾军人的健康调查发现，下肢截肢军人心血管疾病的发病率远高于其他军人［包括心肌梗死（42%[1]、19.8%[2]）、高血压（43.6%[3]、42.7%[4]）、高胆固醇（38.9%[5]）、高血脂（37.6%[4]）、冠脉粥样硬化（12.4%[6]）、主动脉瘤（5.8%[7]）、外周血管疾病（5%[4]）等］，特别是非创伤性下肢截肢者尤为明显。已有研究表明，心血管疾病的形成与血流速度、血压、血管壁面剪切应力等血流动力学参数密切相关[8-10]，而截肢导致的人体血管和肌肉组织的丢失，会引起血流的重新分布和血管末端阻力的变化[11]，进而影响人体的血流动力学分布。因此，截肢是否会对人体心血管系统产生影响自然成为一个值得深入研究的课题。
目前基于血流动力学的心血管系统研究通常采用计算流体力学方法结合血管成像技术，如计算机断层扫描（computed tomography，CT）成像、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、超声（ultrasound，US）成像和数字减影图像等，以及三维重建技术进行数值模拟，虽然可以细致地获得心血管系统内的血流动力学分布规律，但仍需再结合体外实验、动物实验或临床试验等进行验证或开展更深入的心血管疾病发生发展规律和机制等方面的研究。其中，动物实验被认为是心血管疾病研究从实验室走向临床治疗中不可缺少的关键环节[12]。建立和使用合适的动物模型对动物实验结果的合理性以及相关基础研究和诊疗工具的发展具有重要的作用[13]，如遗传性高血脂家兔（Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit，WHHL）模型被证明是最适合研究动脉粥样硬化的动物模型[14-15]，大鼠冠状动脉结扎模型常用于研究心肌梗死[16-17]，而自发性高血压大鼠模型则适用于研究先天性高血压[18]。
因此，在针对前述截肢与心血管系统关系的研究中，采用动物实验验证和探索截肢能否对心血管系统产生影响是十分必要的。如何建立动物模型、利用哪些指标监测心血管系统变化等是首先需要解决的问题。虽然已有研究采用截肢动物研究截肢过程中动物心脏功能的变化[19]（术后即处死实验动物），但就截肢对于动物心血管系统的长期影响还未见相应的研究模型。
为此，本文选择兔作为实验对象，截肢并行肌肉成形术，通过监测总胆固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）等生化指标及动脉病理检测［苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、范基林（van Gieson，VG）染色］来获取兔心血管系统的改变，以期建立一种成活率高、稳定性好、便于监测的动物实验模型，为后续进一步深入研究截肢对心血管系统的影响提供动物实验平台。
1 材料与方法
本文的动物实验研究主要分为三个阶段：截肢手术、动物生化指标检测以及动物病理组织检测。
1.1 实验动物选择
选择合适的动物品种对于能否成功造模非常重要。常规动物实验通常选择大鼠、小鼠、猪、狗、兔等作为研究对象，其中猪[20]和兔[21]是两种心血管系统与人类最为相似的动物，但考虑到动物模型的制作难度及取材的便利性，实验兔模型具有造模时间短而且成本低的特点，因此本文选择兔作为实验动物研究对象。
实验室环境下兔子的平均寿命为10年[22]，针对成年期这一阶段，对于实验兔来说，18.25天的时间相当于人类寿命的一年（365天）[23]，因此本文进行合理假设，将实验兔截肢术后7天、14天、60天的心血管系统变化类比人类截肢后约18周、36周、3年的心血管系统变化。
本实验选用健康活力好、无运动障碍、无皮肤病的无特定病原体（specefic pathogen free，SPF）新西兰兔［SCXK（川）2019-031］，体重（2.2 ± 0.31）kg，购自成都达硕实验动物有限公司。动物的饲养及实验过程依照《成都市实验动物管理条例》相关规定进行，经四川大学医学伦理委员会批准通过。
1.2 截肢手术
截肢方法采用已在临床广泛使用的肌肉成形术，可以减少截肢手术过程对实验兔血液循环系统的影响。
实验兔共12只，分为正常组（n = 6）和截肢组（n = 6），均在动物笼中单笼饲养（如图1a所示）。两组实验兔在笼中均可自由活动、进食和饮水，室温控制在25 ℃左右，12 h光照与黑暗循环交替。经过7天的适应期喂养后，对截肢组实施手术。用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规剪毛后依次切开皮肤，分离肌层、浅深筋膜，游离血管、神经并于近心端结扎，膝关节以上股骨远端用手术钳夹断，依次切断肌肉、血管及神经，保留足够的肌肉长度（截断位置向前5 cm处），将肌肉缝合包住股骨（如图1b所示）。术后将实验兔放于加热板上，待状态稳定后，送入原来的动物笼中。术后连续三天为截肢组注射抗生素（青霉素11 000～22 000 U/kg，肌肉注射），以避免截肢组实验兔因伤口感染死亡。
图1
实验动物及截肢手术
a. 单笼饲养实验兔的生活环境；b. 实验兔膝上截肢手术
Figure1. Experimental animals and amputationa. the living environment of experimental rabbits; b. lower limb amputation
1.3 血液生化检查
临床通常采用LDL-C和TC[24]等指标进行心血管疾病的初筛。TC水平与较高的心血管疾病死亡率相关[25-27]；LDL-C与冠心病风险呈正相关，与动脉粥样硬化[28]之间存在剂量依赖关系。因此，TC和LDL-C升高被普遍认为是心血管疾病的主要危险因素[29]，而它们同样可以作为实验兔心血管系统发生变化的参照[30-31]。故本文采用兽用生化分析仪（BS-240VET，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）对兔血清中的TC及LDL-C含量进行检测。
1.4 组织病理切片检查
为与生化指标结果相结合进一步验证实验兔心血管系统的变化，饲养期结束后，开展动物模型的组织病理检测工作。在兔体内，动脉粥样硬化病变主要分布在主动脉弓、胸主动脉、肋间动脉起源处[21]，故取股动脉、主动脉弓、腹主动脉、胸主动脉作病理切片检查（HE染色），同时进行VG染色以标明血管中的肌纤维（呈黄色）、胶原纤维（呈红色）和弹力纤维（呈黑色）。另取实验动物的心、肝、脾、肺、肾做基础疾病分析，排除实验动物本身疾病对于心血管系统的影响。解剖之后取材制标本，并按病理检验SOP程序进行。采用数字切片扫描仪（Pannoramic 250，3DHISTECH，匈牙利）对切片进行观察和图像采集。VG染色后，每张切片先于40倍镜下观察全部组织，再根据组织大小及表达情况分别选取3个区域放大400倍采集图像。HE染色后，每张切片先于40倍镜下观察全部组织，察看大体病变情况，再选择要观察的区域采集放大100倍和400倍的图片，观察具体病变。
1.5 统计分析
所有数据均用SPSS 26.0软件进行统计分析。所有数据表示为均值±标准差。采用单因素方差分析比较正常组和截肢组血清中的LDL-C及TC含量。所有的统计分析中，检验水准均为0.05。
2 结果
术后实验兔存活良好，进食进水无异常，且能够在缺损肢体的情况下进行正常活动。动物模型的存活意味着造模成功，是实验后续开展的基础。
行截肢术后，各组实验兔血清中的LDL-C含量、TC含量如图2所示。截肢组LDL-C含量、TC含量与正常组的差异有统计学意义（P<0.05），说明截肢组这两项危险指标在术后发生显著变化。
图2
LDL-C含量、TC含量对比图
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VG染色观察弹性纤维的形态及变化情况如图3所示，动脉血管中层弹力膜呈黑色波浪线型，由内向外层状排列。定性比较发现，正常组实验兔弹性纤维层总体厚度宽于截肢组。因实验兔本身体重有差异导致内脏大小不完全相同，故采用弹性纤维面积表达百分比（elastic fiber area expression percentage，EFEP）作为动脉病变程度的指标更为合理。正常组主动脉弓及腹主动脉处的EFEP分别为20.69%和13.26%，截肢组分别为11.28%和7.8%。
图3
术后60天截肢组主动脉弓及腹主动脉VG染色图像
弹性纤维由图中黄色箭头标示
Figure3. Van Gieson stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationelastic fibers are indicated by yellow arrows in the figures
主动脉弓及腹主动脉的HE染色结果如图4所示，在光镜观察下，本实验部分动脉出现内膜层内皮细胞脱落、中膜层平滑肌细胞变性坏死、弹性纤维断裂、黏液样物质沉积和管腔内红细胞蓄积等病理改变。
图4
术后60天截肢组主动脉弓及腹主动脉HE染色图像
中膜层平滑肌细胞变性坏死由绿色箭头标示，弹性纤维断裂由黑色箭头标示，黏液样物质沉积由蓝色箭头标示
Figure4. Hematoxylin-eosin stained images of aortic arch and abdominal aorta 60 days after amputationdegeneration and necrosis of smooth muscle cells in the middle membrane are marked by green arrows, elastic fiber breakage is marked by black arrow, and myxoid deposition is marked by blue arrow
3 讨论
本文选用兔作为实验动物是基于兔子与人心血管系统的相似性[32]，与啮齿类动物相比，兔子在进化上更接近灵长类动物[13]，特别是家兔的脂蛋白谱及对胆固醇的敏感性与人类完全相同，使得兔动脉粥样硬化的病理演化过程中，从早期到晚期病变都与人类相似[33]。
血液中TC含量作为心血管系统发生病变的重要因素[30]，与较高的心血管疾病死亡率相关[25-27]，实验兔在截肢术后TC含量急剧升高，说明截肢术后实验兔的心血管系统有脂质沉积等病变的趋势。正常状态下，TC含量中的50% ～ 60%由LDL-C组成[34]，占比最大，故血液中的LDL-C含量变化将直接影响TC含量。相比正常组，截肢组血清中LDL-C含量显著增高，说明其TC含量升高的主要原因是LDL-C含量的变化。而LDL-C含量的增大会引起泡沫细胞的形成及增殖，后者刺激血管平滑肌细胞及纤维组织增生，以致粥样斑块形成并导致动脉粥样硬化[35-36]和冠心病[37-38]等心血管疾病的发生。常用的心血管疾病动物模型WHHL兔[15]则因缺少LDL-C受体而极易患动脉粥样硬化、心肌梗死等心血管疾病，表明LDL-C含量的升高会使实验兔有患心血管疾病的趋势。结合前述中TC作为心血管系统发生病变的主要因素，术后截肢组血清中TC和LDL-C含量显著高于正常组的这一现象，表明截肢组患心血管疾病的风险增大。
生化检测结果初步预测实验兔的心血管系统发生了病变，而动脉病理检测结果则证实了这一预测。实验兔动脉的VG染色结果显示，截肢组主动脉弓和腹主动脉切片的EFEP与正常组相比明显下降（腹主动脉：7.8%比13.26%；主动脉弓：11.28%比20.69%），表明截肢术后兔的动脉弹性变小。动脉弹性功能不仅是收缩压、舒张压、脉压等血流动力学参数的重要决定因素, 而且反映了动脉内皮功能状况[39]。同时，动脉弹性功能的减退也是心血管疾病危险因素的重要标志[40]。而HE染色结果显示，截肢组术后动脉发生了弹力纤维断裂、平滑肌细胞坏死、黏液物质沉积等病理现象，说明在动脉弹性发生变化的基础上，截肢组发生了心血管系统病变，标志着该动物模型的成功建立。
因兔腿部的骨骼和肌肉结构与人相似，本文采用适用于人体的肌肉成形术进行动物造模，术后各组实验兔存活良好，表明该方法完全适用于动物截肢，并且能够有效防止术后实验兔因运动造成伤口的裂开及断骨露出。术后对实验兔心血管系统的动态监测，是通过采血进行生化检测来实现，在采血周期为一周的前提下几近于无创检测，对动物模型没有本质上的影响，方便快捷，安全性高。另外，动物的饲养环节也非常简便，只需定期给予动物水和饲料（无高胆固醇物质）即可。从经济层面讲，该方法成本较低，便于大规模地制作动物模型以开展研究。
4 结论
本文对截肢兔进行长时间的喂养，期间监测实验兔的生理指标，实验结束后对实验兔进行组织病理检测，结果显示截肢术后兔的心血管系统发生了病变且病变程度随时间增长进一步加重，标志着成功地建立了关于截肢对心血管影响研究的动物模型，为研究截肢对心血管系统的影响提供了一种方法，也为后续深入研究截肢后心血管疾病的发生机制、不同截肢水平对心血管系统的影响程度提供了经济适用的动物实验平台。同时，该动物模型同样可以投喂特定的药物或者特种饲料来建立特定心血管疾病的动物模型，可用于指导截肢患者的饮食及用药，以防患者因饮食习惯或不当用药引起或加重自身的心血管疾病。本文的实验方法仍然存在可以改进的地方，如是否需要对正常组进行“假手术”以防动物心理对实验结果产生影响。另外，在本实验基础上进一步提高动物的存活率、将该动物模型的造模方法应用于其他动物等仍需进一步的研究。
重要声明
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：蒋文涛主要负责项目主持、实验设计以及论文审阅修订；闵磊主要负责动物实验方案的制定及实施、实验数据分析及论文编写；李忠友主要负责数据分析指导以及论文修订；李潇、魏君如、刁珺杰参与结果讨论及论文修订；白逃萍和晏菲主要负责实验方案设计指导。
伦理声明：本实验通过了四川大学医学伦理委员会的审批（批文编号：K2022002）。
