韧带是致密的纤维结缔组织，通过骨间连接维持关节的稳定性。运动损伤或组织老化引起的韧带撕裂通常需要手术干预，目前使用自体、异体或人工韧带作为移植物进行重建是治疗该类疾病的金标准，但这些移植物都存在诸多弊端。随着材料学和制造技术的发展，以生物支架为基础的工程化韧带组织有望成为新的组织供体，通过模拟天然组织的结构、成分和生物力学性能来达到再生组织的目的。本综述根据近期韧带组织工程的体外和动物实验研究，评估了以仿生性为设计原则，使用不同材料、制造技术和生物因素制造的纤维结构支架、多相界面支架和生物组织衍生支架的各项性能以及在促进韧带修复和重建中的效果。最后，总结并展望未来韧带组织工程研究中生物支架的发展方向。
引用本文： 徐飞, 张蕾. 韧带组织工程仿生性支架的研究进展. 生物医学工程学杂志, 2021, 38(4): 812-818. doi: 10.7507/1001-5515.202009085 复制
引言
韧带是连接于骨之间，维持着关节在运动和静止状态下稳定性的致密结缔组织[1]。韧带的力学特性导致其容易在运动损伤或组织老化后发生撕裂伤[2]，且修复后连接处以排列杂乱的纤维瘢痕组织为主，生物力学性能远不如正常组织[3]。美国每年肌肉骨骼损伤的病例约有 3 300 万，其中肌腱/韧带损伤占比 50%，平均每年约有超过 30 万患者通过手术来修复损伤的肌腱或韧带[1，4]。在我国，60 岁段肩袖损伤发病率为 20%，而 70 岁段则高达 31%[5]，但韧带损伤的发病率无确切统计数据。移植手术虽然可以在短时间内恢复部分力学功能，但使用自体、异体或异种移植物存在供体部位并发症、供体来源受限、免疫排斥、病原体传播以及移植物失效等问题[4]。而以 Leeds-Keio、LARS 为代表的人工韧带/肌腱产品在临床应用中虽然表现出了良好的初始力学强度及术后关节稳定性，但材料本身的粘弹性缺乏、磨损老化以及有限的自体组织再生导致术后中远期出现滑膜炎、移植物力学强度受损甚至失效等问题，使人工韧带/肌腱移植物的临床应用备受争议[6-7]。
韧带组织工程的目的是结合支架、细胞、生化因子、力学刺激，在体外构建替代组织，重建损伤韧带的结构和功能。而支架作为结构基础提供了力学支持和细胞微环境，功能与韧带细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相似，在进行韧带组织工程支架的设计时，需以仿生性为原则在宏观、微观的结构、组成以及力学性能方面模仿天然韧带组织。目前韧带组织工程研究最为广泛的是纤维支架和多相界面支架，纤维可进一步捆绑成束、编织或针织为不同结构的支架，主要作用为早期负载和后期韧带化，而界面支架的作用则主要是促进腱骨界面重建，最终使再生韧带锚定于骨质内。近年来，生物组织衍生支架因为对原组织的结构、组成和力学性能的保留而在韧带或界面组织工程中的研究日益广泛，其中的书样脱细胞支架创新性较为显著。
1 支架材料
综述中韧带或肌腱组织工程研究所涉及的支架材料主要分为合成聚合物、天然聚合物、无机骨引导材料、生物组织衍生材料。合成多聚物主要包括聚己内酯（poly-caprolactone，PCL）、左旋聚乳酸（poly-l-lactic acid，PLLA）、聚羟基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）、聚乳酸共己内酯（poly-l-lactide-co-caprolactone，PLCL）、聚乳酸共羟基乙酸（polylactide-co-glycolide，PLGA）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）等。天然聚合物主要包括胶原蛋白（collagen，COL）、丝素蛋白（silk fibroin，SF）、蚕丝、壳聚糖、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）、纤维素、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）、海藻酸盐、明胶（gelatin，GEL）等。无机骨诱导材料主要包括羟基磷灰石（hydroxylapatite，HAp）、磷酸三钙（tertiary calcium phosphate，TCP）等。生物组织衍生材料包括脱细胞的皮质骨、肌腱、纤维软骨、脂肪或骨-纤维软骨-肌腱复合体组织等。
2 支架制造技术
纤维结构常用于韧带或肌腱组织工程支架的设计中，常规静电纺丝技术可通过电场作用将材料溶液喷射成丝，通过多项参数可调整纤维的排列[8-9]或直径[10]。熔融静电纺丝能够制造更为精确的纤维图形，且可重复性强，例如模仿卷曲胶原纤维结构的特定波长和振幅的正弦波形纤维[11]，进一步提升了纤维拓扑结构对细胞的引导效应。而湿纺技术则是将纺液挤出后在凝固浴中纤维成型，可制造纳米至微米级别纤维[12]，操作简单但对纤维排列和图形设计的精确性不足。可将静电纺丝等纤维制造技术与拧捻、编织、针织技术相结合[13-15]，通过调整纤维丝或纤维束的数量制造出满足尺寸和力学强度要求的三维支架，还可通过调整编织密度来获得具备不同孔隙率、编织角度以及力学性能的分级结构支架[16]。在纤维或编织结构的基础上通过不同交联技术使用凝胶材料对支架进行材料复合或化学改性，同时可通过冷冻干燥形成多孔海绵结构[17-18]。
目前兴起的三维（three-dimensional，3D）打印技术因为精确的图案和三维结构控制能力而用于多领域组织工程的支架制造，但在纤维结构制造方面并不具备优势，所以在韧带或肌腱组织工程中多用于腱骨界面重建[19-20]、小关节韧带重建[21]以及肌腱修复[22]的研究中。使用载有细胞的生物墨水进行支架打印节省了细胞种植和黏附时间，直接实现了细胞的均匀分布，未见明显的细胞毒性[22-23]，但不适合的支架孔径或连通性可能会抑制细胞增殖[23]。
3 纤维支架
纤维支架的设计参照了韧带的胶原纤维组成和结构，从初始使用单种材料通过纺丝技术制造平行纤维结构，到逐渐使用混合或复合材料结合编织和针织技术制造结构更为复杂的分级纤维结构和芯鞘结构支架，通过对结构和材料仿生性探索的不断深入，纤维支架的各方面性能提升明显。
3.1 复合或混合材料纤维支架
韧带 ECM 中存在胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖等多种成分，各具功能，而目前在韧带组织工程的研究中亦倾向于研究复合材料或混合材料支架，因为材料具备各自优点，可以互补缺陷。混合材料支架是将几种原材料按比例通过物理手段搅拌混合，再进行支架制造。有研究用不同混合比例的 PLLA/COL-I 溶液纺丝了模拟天然肌腱结构和直径的纤维束，发现 75/25 比例组纤维束的杨氏模量和抗张强度较 50/50 组更强，交联后纤维束的刚度和韧性与肌腱相仿，生物相容性良好[24-25]。相似的研究也使用了不同种类和比例的合成/天然多聚物混合材料进行纤维支架制造，如 PCL/纤维素[26]、PCL/COL[27]，均发现混合材料纤维支架较单纯合成多聚物支架更有利于细胞的黏附和增殖，且在某个混合比例下更加明显。有研究在合成多聚物材料中添加无机颗粒，如二氧化硅[28]或羟基磷灰石[29]，可见颗粒均匀分布于纤维表面，细胞在这类“珠-弦结构”纤维上表现出了更好的黏附、迁移和增殖能力，促进了 ECM 沉积。
复合材料支架是指多种不同性质的材料通过化学或物理方式复合构成多相系统。复合材料在改善支架力学性能和生物活性方面亦有突出表现，如在两层 PLGA 纳米有序纤维片中夹入同轴向排列的 PLLA 微米纤维片，卷为柱状支架后测得极限载荷约为 200 N，重建兔前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）后的初始移植物极限载荷（130 N）与形变（2～8 mm）均与天然 ACL 相仿[30]。Mengsteab 等[16]首次设计了使用 4 根 PET 和 20 根 PLLA 线进行复合分级编织的“Tiger”支架，该复合物支架的力学强度达到了目前兔 ACL 重建研究中的极限载荷峰值（996 N），使用以上两种力学强化支架进行兔 ACL 重建，术后 12 周时支架结构均保持完整且支持组织长入。Liu 等[31]以复层编织支架为基础，通过复合 SF/PLCL 编织提高了 SF 编织支架的孔隙率和力学强度，又通过对 PLCL 编织支架使用左旋赖氨酸和透明质酸表面改性促进了间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在支架上的黏附、迁移和增殖活动[32]。Chang 等[33]在 PLLA 有序纤维支架上进行了三种化学优化，发现了 COL 在支架的表面改性显著增强了细胞的渗透，可在 1 周内实现均匀分布，后使用成纤维细胞生长因子和转化生长因子进行顺序生化刺激后显著改善了 ECM 的合成和组织，而纤维蛋白胶可进行纤维片之间的粘合，一定范围内增加了支架的厚度，也可与生长因子协同促进 ECM 合成。在两项兔 ACL 重建研究中，使用的针织蚕丝/COL 海绵复合支架表现出了良好的生物相容性与力学强度，联合细胞化[17]或血管化[34]处理后同步实现了韧带化和腱骨界面重建。
无论是混合材料支架还是复合材料支架，材料间优点叠加而缺陷互补，能够在生物相容性、力学性能或生物诱导性等方面表现出相较于单种材料支架的优势。
3.2 纤维支架的结构
3.2.1 有序纤维
因为韧带胶原纤维均呈现平行有序排列，通过纺丝技术制造的有序结构纤维成为韧带组织工程研究中最常用的结构设计。近期的研究中发现 PCL[8]和 PLGA[35]纤维的有序性均能增强纤维支架轴向力学强度，促进细胞的轴向伸长和排列，诱导 MSCs 的腱向分化以及 ECM 沉积，甚至还能缓解炎性条件下成纤维细胞（fibroblasts，FBs）的分解代谢作用，抑制 ECM 降解[36]。Lu 等[37]通过模拟天然胶原纤维的直径和结构制造了 SF 平行槽脊结构膜，槽宽 5～20 μm，发现沟槽的有序拓扑结构对 MSCs 生物学行为产生了明显的接触引导效应，且 10 μm 槽宽下细胞的狭长形态和腱系基因上调最显著，而这可能与黏着斑激酶的激活相关[38]。
一项研究中将 PCL 有序纳米纤维束植入羊尸体进行 ACL 重建，力学检测发现支架植入前在抗疲劳性、趾区刚度方面以及植入后的关节前后稳定性与 ACL 相仿[39]。Petrigliano 等[40]使用了有序 PCL 纳米纤维支架进行大鼠 ACL 重建，12 周后发现骨隧道和关节内区域支架上均有胶原沉积，生物力学检测发现极限载荷与刚度均高于体外支架，但仍明显小于天然韧带。Leong 团队[41]制造了 PCL/COL 有序纤维支架进行了大鼠 ACL 重建，发现体内移植物的初始极限载荷与刚度值分别为天然 ACL 的 13.5% 和 15.7%，术后 16 周增强到 31.3% 和 28.2%。随后使用超高分子 PCL 制作相似的支架进行大鼠 ACL 重建，未进行体外力学性能检测，虽然术后 16 周发现超高分子 PCL 移植物力学强度较普通 PCL 强，但极限载荷和刚度也仅达到天然 ACL 的 41.9% 和 21.3%[42]。综合上述研究发现该类合成多聚物制造的有序纤维支架虽然能够在体内外诱导腱系分化以及 ECM 沉积，但植入后的力学强度较 ACL 仍存在较大差距，需要在结构和成分上进一步优化。
3.2.2 芯鞘结构
韧带存在胶原纤维、纤维束等多级结构，各级纤维束均由相应腱内膜与腱鞘膜包裹，这种芯鞘结构保证了内部纤维结构的紧密有序和完整性，而包膜的胶原网络也增强了韧带整体的力学强度。有学者通过静电纺丝制造了 PLLA 有序纳米纤维垫，并卷为纤维束，将 100 束平行排列的纤维束捆绑后在表面纺丝无序 PLLA 纤维鞘，发现束内纤维紧密相邻且轴向有序排列，成功模拟了分级纤维和芯鞘结构，支架的应力应变曲线存在良好的趾区和线性区，刚度与韧带相仿但抗张强度较低，FBs 可渗入纤维间并表现出良好的增殖活性[43]。Teuschl 团队[13-14]使用脱胶的蚕丝纤维进行分级拧捻和编织，使用管状编织外鞘包裹了内部两股编织绳索，在编织纤维的基础上构建了芯鞘结构支架，极限载荷和刚度分别达到 1 450 N 和 200 N/mm，均在羊 ACL 力学强度范围内，术后 1 年发现关节内支架蚕丝明显减少，大量新生韧带组织长入，而移植物与骨隧道界面处球状新生骨相连，自体血管基质组分的使用未见远期效果。Cai 等[44]则先制造了 PLCL/SF 纳米纤维包裹的 PCL 纤维束，再将该芯鞘结构线针织为 3D 支架，支架极限载荷、弹性模量分别为 77 N、91 MPa，体外显著上调 MSCs 的腱系标记基因，使用该支架对兔髌韧带缺损进行修复，术后 6 月修复组织的组织学和力学表现均强于 PCL 纤维支架，与天然组织相近。由此可见，包有外鞘的分级纤维支架通过模拟天然韧带结构提高了支架完整性和力学强度的同时还支持细胞和组织的长入。
4 多相腱骨界面支架
腱骨界面由肌腱、纤维软骨、钙化纤维软骨以及骨组织连接构成，该组成和结构梯度形成的力学性能差异能够避免应力传导过程中因应力集中造成的组织损伤。界面组织工程的难点在于如何同时再生多种组织类型并恢复其独有的梯度结构和力学特性，而根据仿生性原则设计的多相支架为再生这类复杂组织带来了希望。支架上根据结构或组成差异所划分出的不同区域即为相，如常见的三相腱骨界面支架通常包括韧带相、纤维软骨相和骨相。无机物是骨组织工程中常用的骨引导材料，而生长因子则具备诱导多系分化能力，近期的界面组织工程研究常基于两者的成分梯度构建支架的异质相。
4.1 无机物梯度支架
TCP 因为其固有的骨诱导特性和适宜的降解率成为了骨和界面组织工程中常用的添加材料。一项研究利用 3D 打印技术制造了多孔 PCL（腱区）-管状 PCL/TCP（纤维软骨区）-多孔 PCL/TCP（骨区）三相支架，从骨区到腱区形成了 TCP 梯度，三相均拥有良好的孔隙连通度，分别支持 FBs、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和成骨细胞的黏附和增殖，软骨诱导培养 21 天后支架纤维软骨区内软骨生成，在植入小鼠皮下 8 周后支架相内分别上调了成腱、软骨、骨标记基因，而 COL-X 的上调进一步明确了钙化软骨形成[19]。另一项研究使用 3D 打印的 PCL/PLGA/β-TCP 支架套绕自体腘绳肌肌腱固定于股骨和胫骨隧道内完成了兔 ACL 重建，形成了支架和自体肌腱之间的 TCP 梯度，术后 12 周可见平滑的腱骨过渡组织，含丰富纤维软骨，骨隧道面积亦显著缩小[20]。更有趣的是，有学者用聚乙二醇凝胶连接了两端的 COL/GAG 与钙化 COL/GAG 材料构成了三相支架，通过优化凝胶的粘弹性过渡过程强化了凝胶韧性，降低了界面支架的应力集中，该界面支架的设计结合了矿物梯度与应力分散机制[45]。
HAp 与 TCP 同属于磷酸钙材料，降解周期更长，具有良好的骨引导性，在界面组织工程的支架设计中应用广泛。Calejo 等[12]设计的三相纤维编织支架分别使用了湿纺 PCL/GEL 有序纤维和 PCL/GEL/HAp 无序纤维从两头编织到中间交汇，人脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）在高 HAp 浓度的无序纤维区域沉积了丰富的 COL-I，而交汇区域则沉积了 COL-II 和 COL-X，分别提示了骨和软骨基质的合成。另一项研究中发现在整合了 HAp 浓度梯度的脂肪脱细胞支架上，人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）分别在支架的韧带、软骨、骨相区域沉积了 COL-I、GAG+COL-II 和钙质，与腱骨界面基质组成梯度相似，植入大鼠肩袖损伤处 8 周后形成了成熟的胶原纤维和纤维软骨结构，潮线清晰可见，修复组织的力学强度显著优于对照[46]。
界面支架中无机物梯度的建立均遵循了仿生原则，高浓度区域对应骨相，中间的过渡区对应钙化和非钙化的纤维软骨相，而无钙化区对应韧带相，各相在有无结构梯度的情况下均可不同程度诱导 MSCs 向相应谱系分化并沉积 ECM，在动物体内亦能重建结构成熟的腱骨界面。
4.2 生长因子梯度支架
天然腱骨界面的 ECM 中均存在着有利于各自谱系分化和稳态维持的生化因子环境，所形成的生化梯度为支架的仿生性设计提供了新思路。生长因子可通过直接掺入混合、复合材料或慢病毒基因转染的方式载入支架。在 Han 团队[47-48]的两项界面组织工程研究中，分别通过 LBL 技术在无序 PCL 纤维支架表面覆盖了含有 BMP-7[47]、BMP-2 和 SDF-1α[48]的聚电解质凝胶材料，兔 ACL 重建后 12 周均发现含有生长因子的支架明显促进了骨隧道的新骨形成和骨整合，显著缩小了骨隧道面积，强化了界面连接的生物力学强度。在一项更为复杂的界面支架研究中，将针织蚕丝支架划分三区并分别复合不同材料，使用磷脂酰丝氨酸功能化后将不同生长因子基因整合到相应区域中，具体为 A 区（SF）-B 区（SF/CS/HA+慢病毒 TGF-β3）-C 区（SF/HAp+慢病毒 BMP-2），体外培养 2 周后 BMSCs 在 A、B、C 区分别上调了成腱、成软骨、成骨标记基因以及载入的生长因子基因表达，将该针织网卷为圆柱状支架后（两端由外到内依次为 C、B、A 区）进行兔 ACL 重建，术后 12 周发现基因携带支架形成了典型的骨-软骨-韧带结构界面，特别在外层骨区形成了完整的骨质层，拔出载荷（42 N）显著高于对照，与天然 ACL 相近[15]。
也有研究在支架中同时整合了结构、无机物和生长因子梯度来构建界面支架。如 Jiang 团队[30]在早期研究中分别用 PLGA/HAp/BMP-2 和 PLGA 溶液纺丝了支架的有无序和有序纳米纤维相，支架上 FBs 的碱性磷酸酶表达随 nHA 和 BMP-2 浓度梯度升高而增强，兔 ACL 重建 12 周后发现移植物-骨界面处纤维软骨过渡区域再生，类似天然腱-骨界面结构。该团队在后续的研究中，以相同的方法制造了两相 PLGA 纳米纤维支架，在有序和无序纤维相分别整合了 TGF-β3 和 BMP-2/HAp，在整体支架中呈现反向梯度，无序纤维联合 BMP-2/HAp 梯度协同促进了 BMSCs 的成骨分化梯度，结果与早期研究一致，但 TGF 联合有序纤维的软骨分化效应不明显[49]。
整合了无机物梯度或/和生长因子梯度的多相支架均具备体外诱导 MSCs 向韧带、软骨、骨系不同程度分化的潜能，甚至在动物体内重建了结构成熟的腱骨界面，但界面结构和组成的复杂性也为组织工程中仿生支架的设计和临床转化带来了挑战。
5 生物组织衍生支架
生物组织衍生支架直接来源于组织或器官，通过物理和化学法脱细胞后保留 ECM，支架在结构、组成、功能上较其他类型支架更接近天然组织，且低免疫原性保证了生物相容性。近期有多项研究使用单种或复合体组织制造了脱细胞支架用于肌腱或韧带的组织工程研究，通过细胞再植、力学刺激或材料添加取得了一定效果，但同样存在不足。
有研究显示脱细胞肌腱的纤维平行结构和部分力学性能（抗张强度、刚度、极限应变）与脱细胞前无显著差异[50]。在异种脱细胞肌腱重建兔 ACL 的研究中发现，支架的细胞再植联合力学刺激显著增强了术后移植物的力学强度[51]，而复合 HAp/金纳米颗粒支架可促进宿主组织的再生和重塑[52]，但均存在不同程度的炎症和移植物降解或坏死的情况。在界面组织工程中，脱细胞骨-纤维软骨-肌腱复合组织是具备天然结构和成分梯度的多相支架。Su 等[53]取猪跟腱处的腱骨连接复合体，脱细胞后发现胶原纤维和软骨纤维的结构基本保留，而 COL 和 GAG 部分保留，损失程度因区域而异，抗张强度和弹性模量与人跟腱相似，鼠 BMSCs 在支架上表现出了良好的黏附、渗入和增殖活动，且 2 周后相应区域内分别上调了肌腱和骨标记基因，细胞再植支架重建兔内侧副韧带 8 周后相比单纯脱细胞肌腱显著促进了隧道内骨整合。另一项研究取狗髌骨-髌韧带复合体进行脱细胞，确认了纤维软骨基质以及胶原纤维轴向结构的保留，在拉伸刺激下促进了 BMSCs 的渗入、轴向排列以及腱系分化，但软骨系分化不明显[54]。
Tang 团队[55-58]近年来致力于书样结构脱细胞支架联合细胞片的构建体研究，书样结构即将整块支架切片为书页结构，组织片分离侧为书口，对侧相连部为书脊，该结构有利于支架之间或与细胞片的整合。他们先后分别利用兔骨[55]、纤维软骨[55-56]以及肌腱[57]组织制造了书样脱细胞支架，并在体外明确了支架具备良好的生物相容性和诱导 MSCs 向支架本源组织谱系分化的能力，后联合 MSCs 细胞片分别进行了兔髌骨-膑腱连接和跟腱缺损处的修复，发现修复组织的结构和功能良好。该团队近期又设计了联合脱细胞骨、纤维软骨、肌腱的复合书样支架，支架之间通过书页交叉连接，形成了类似腱骨界面的四个过渡区域，将 BMSCs 细胞片夹入书页间均匀分布，2 周后在相应区域内分别上调了骨、软骨、韧带系标记基因和蛋白的表达，后将该支架/细胞构建体植入兔髌骨-膑腱缺损处，术后 16 周在局部形成了连续的骨-纤维软骨-肌腱界面组织，组织学和生化分析证明了结构与组成的梯度性，界面的力学强度也显著高于对照[58]。
在研究中发现生物组织衍生支架具备良好的生物相容性，因为不同程度保留了原组织 ECM 微环境，具备诱导 MSCs 向支架的本源谱系分化和组织再生的潜力。但该类支架依然存在细胞残留导致免疫炎性反应[51-52]或不同程度的成分丢失[53，56-57]的问题，导致其力学强度和诱导分化能力削弱。有研究通过优化十二烷基硫酸钠的浓度和脱细胞时间，在保证充分细胞脱除的前提下提高了 ECM 成分和生长因子的存留比例，支架表现出了对 MSCs 更显著的诱导分化效应[56]。因此，将来应该在进一步优化脱细胞技术的同时完成对脱细胞支架结构、组成以及力学性能的全面评估。
6 总结与展望
韧带组织工程支架的研究涉及广泛的材料和制造技术，其仿生性体现在通过模仿韧带的组成和宏观、微观结构实现与之相似的力学性能和理化环境，能够早期在体内承受生理负载并促使组织长入，完成从移植物到自体组织的过渡。在动物体内研究中发现该类支架还存在着力学强度、抗疲劳性和组织再生能力不足等问题，而基于复合材料的仿生多相支架依然是将来韧带组织工程支架设计的主要思路，但某些结构和组成上的仿生性很难实现。生物组织衍生支架的出现为支架的设计带来了简化方案，其在组成和结构上的固有仿生性使之具备了良好的生物诱导环境和力学性能，包括韧带的抗蠕变以及界面的应力分散能力，但脱细胞后基质的成分损失和体内炎症导致的基质降解均削弱了支架性能。未来韧带组织工程支架的研究方向可以利用生物组织衍生支架的仿生性优势，根据需要整合不同结构的天然、合成多聚物或无机材料构建力学、生物学性能强化的多相支架，再联合力学刺激、生长因子、MSCs 来促进组织再生和改善炎性环境，同步实现关节区域内韧带和隧道内腱骨界面的重建。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
韧带是连接于骨之间，维持着关节在运动和静止状态下稳定性的致密结缔组织[1]。韧带的力学特性导致其容易在运动损伤或组织老化后发生撕裂伤[2]，且修复后连接处以排列杂乱的纤维瘢痕组织为主，生物力学性能远不如正常组织[3]。美国每年肌肉骨骼损伤的病例约有 3 300 万，其中肌腱/韧带损伤占比 50%，平均每年约有超过 30 万患者通过手术来修复损伤的肌腱或韧带[1，4]。在我国，60 岁段肩袖损伤发病率为 20%，而 70 岁段则高达 31%[5]，但韧带损伤的发病率无确切统计数据。移植手术虽然可以在短时间内恢复部分力学功能，但使用自体、异体或异种移植物存在供体部位并发症、供体来源受限、免疫排斥、病原体传播以及移植物失效等问题[4]。而以 Leeds-Keio、LARS 为代表的人工韧带/肌腱产品在临床应用中虽然表现出了良好的初始力学强度及术后关节稳定性，但材料本身的粘弹性缺乏、磨损老化以及有限的自体组织再生导致术后中远期出现滑膜炎、移植物力学强度受损甚至失效等问题，使人工韧带/肌腱移植物的临床应用备受争议[6-7]。
韧带组织工程的目的是结合支架、细胞、生化因子、力学刺激，在体外构建替代组织，重建损伤韧带的结构和功能。而支架作为结构基础提供了力学支持和细胞微环境，功能与韧带细胞外基质（extracellular matrix，ECM）相似，在进行韧带组织工程支架的设计时，需以仿生性为原则在宏观、微观的结构、组成以及力学性能方面模仿天然韧带组织。目前韧带组织工程研究最为广泛的是纤维支架和多相界面支架，纤维可进一步捆绑成束、编织或针织为不同结构的支架，主要作用为早期负载和后期韧带化，而界面支架的作用则主要是促进腱骨界面重建，最终使再生韧带锚定于骨质内。近年来，生物组织衍生支架因为对原组织的结构、组成和力学性能的保留而在韧带或界面组织工程中的研究日益广泛，其中的书样脱细胞支架创新性较为显著。
1 支架材料
综述中韧带或肌腱组织工程研究所涉及的支架材料主要分为合成聚合物、天然聚合物、无机骨引导材料、生物组织衍生材料。合成多聚物主要包括聚己内酯（poly-caprolactone，PCL）、左旋聚乳酸（poly-l-lactic acid，PLLA）、聚羟基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）、聚乳酸共己内酯（poly-l-lactide-co-caprolactone，PLCL）、聚乳酸共羟基乙酸（polylactide-co-glycolide，PLGA）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）等。天然聚合物主要包括胶原蛋白（collagen，COL）、丝素蛋白（silk fibroin，SF）、蚕丝、壳聚糖、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）、纤维素、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）、海藻酸盐、明胶（gelatin，GEL）等。无机骨诱导材料主要包括羟基磷灰石（hydroxylapatite，HAp）、磷酸三钙（tertiary calcium phosphate，TCP）等。生物组织衍生材料包括脱细胞的皮质骨、肌腱、纤维软骨、脂肪或骨-纤维软骨-肌腱复合体组织等。
2 支架制造技术
纤维结构常用于韧带或肌腱组织工程支架的设计中，常规静电纺丝技术可通过电场作用将材料溶液喷射成丝，通过多项参数可调整纤维的排列[8-9]或直径[10]。熔融静电纺丝能够制造更为精确的纤维图形，且可重复性强，例如模仿卷曲胶原纤维结构的特定波长和振幅的正弦波形纤维[11]，进一步提升了纤维拓扑结构对细胞的引导效应。而湿纺技术则是将纺液挤出后在凝固浴中纤维成型，可制造纳米至微米级别纤维[12]，操作简单但对纤维排列和图形设计的精确性不足。可将静电纺丝等纤维制造技术与拧捻、编织、针织技术相结合[13-15]，通过调整纤维丝或纤维束的数量制造出满足尺寸和力学强度要求的三维支架，还可通过调整编织密度来获得具备不同孔隙率、编织角度以及力学性能的分级结构支架[16]。在纤维或编织结构的基础上通过不同交联技术使用凝胶材料对支架进行材料复合或化学改性，同时可通过冷冻干燥形成多孔海绵结构[17-18]。
目前兴起的三维（three-dimensional，3D）打印技术因为精确的图案和三维结构控制能力而用于多领域组织工程的支架制造，但在纤维结构制造方面并不具备优势，所以在韧带或肌腱组织工程中多用于腱骨界面重建[19-20]、小关节韧带重建[21]以及肌腱修复[22]的研究中。使用载有细胞的生物墨水进行支架打印节省了细胞种植和黏附时间，直接实现了细胞的均匀分布，未见明显的细胞毒性[22-23]，但不适合的支架孔径或连通性可能会抑制细胞增殖[23]。
3 纤维支架
纤维支架的设计参照了韧带的胶原纤维组成和结构，从初始使用单种材料通过纺丝技术制造平行纤维结构，到逐渐使用混合或复合材料结合编织和针织技术制造结构更为复杂的分级纤维结构和芯鞘结构支架，通过对结构和材料仿生性探索的不断深入，纤维支架的各方面性能提升明显。
3.1 复合或混合材料纤维支架
韧带 ECM 中存在胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖等多种成分，各具功能，而目前在韧带组织工程的研究中亦倾向于研究复合材料或混合材料支架，因为材料具备各自优点，可以互补缺陷。混合材料支架是将几种原材料按比例通过物理手段搅拌混合，再进行支架制造。有研究用不同混合比例的 PLLA/COL-I 溶液纺丝了模拟天然肌腱结构和直径的纤维束，发现 75/25 比例组纤维束的杨氏模量和抗张强度较 50/50 组更强，交联后纤维束的刚度和韧性与肌腱相仿，生物相容性良好[24-25]。相似的研究也使用了不同种类和比例的合成/天然多聚物混合材料进行纤维支架制造，如 PCL/纤维素[26]、PCL/COL[27]，均发现混合材料纤维支架较单纯合成多聚物支架更有利于细胞的黏附和增殖，且在某个混合比例下更加明显。有研究在合成多聚物材料中添加无机颗粒，如二氧化硅[28]或羟基磷灰石[29]，可见颗粒均匀分布于纤维表面，细胞在这类“珠-弦结构”纤维上表现出了更好的黏附、迁移和增殖能力，促进了 ECM 沉积。
复合材料支架是指多种不同性质的材料通过化学或物理方式复合构成多相系统。复合材料在改善支架力学性能和生物活性方面亦有突出表现，如在两层 PLGA 纳米有序纤维片中夹入同轴向排列的 PLLA 微米纤维片，卷为柱状支架后测得极限载荷约为 200 N，重建兔前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）后的初始移植物极限载荷（130 N）与形变（2～8 mm）均与天然 ACL 相仿[30]。Mengsteab 等[16]首次设计了使用 4 根 PET 和 20 根 PLLA 线进行复合分级编织的“Tiger”支架，该复合物支架的力学强度达到了目前兔 ACL 重建研究中的极限载荷峰值（996 N），使用以上两种力学强化支架进行兔 ACL 重建，术后 12 周时支架结构均保持完整且支持组织长入。Liu 等[31]以复层编织支架为基础，通过复合 SF/PLCL 编织提高了 SF 编织支架的孔隙率和力学强度，又通过对 PLCL 编织支架使用左旋赖氨酸和透明质酸表面改性促进了间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在支架上的黏附、迁移和增殖活动[32]。Chang 等[33]在 PLLA 有序纤维支架上进行了三种化学优化，发现了 COL 在支架的表面改性显著增强了细胞的渗透，可在 1 周内实现均匀分布，后使用成纤维细胞生长因子和转化生长因子进行顺序生化刺激后显著改善了 ECM 的合成和组织，而纤维蛋白胶可进行纤维片之间的粘合，一定范围内增加了支架的厚度，也可与生长因子协同促进 ECM 合成。在两项兔 ACL 重建研究中，使用的针织蚕丝/COL 海绵复合支架表现出了良好的生物相容性与力学强度，联合细胞化[17]或血管化[34]处理后同步实现了韧带化和腱骨界面重建。
无论是混合材料支架还是复合材料支架，材料间优点叠加而缺陷互补，能够在生物相容性、力学性能或生物诱导性等方面表现出相较于单种材料支架的优势。
3.2 纤维支架的结构
3.2.1 有序纤维
因为韧带胶原纤维均呈现平行有序排列，通过纺丝技术制造的有序结构纤维成为韧带组织工程研究中最常用的结构设计。近期的研究中发现 PCL[8]和 PLGA[35]纤维的有序性均能增强纤维支架轴向力学强度，促进细胞的轴向伸长和排列，诱导 MSCs 的腱向分化以及 ECM 沉积，甚至还能缓解炎性条件下成纤维细胞（fibroblasts，FBs）的分解代谢作用，抑制 ECM 降解[36]。Lu 等[37]通过模拟天然胶原纤维的直径和结构制造了 SF 平行槽脊结构膜，槽宽 5～20 μm，发现沟槽的有序拓扑结构对 MSCs 生物学行为产生了明显的接触引导效应，且 10 μm 槽宽下细胞的狭长形态和腱系基因上调最显著，而这可能与黏着斑激酶的激活相关[38]。
一项研究中将 PCL 有序纳米纤维束植入羊尸体进行 ACL 重建，力学检测发现支架植入前在抗疲劳性、趾区刚度方面以及植入后的关节前后稳定性与 ACL 相仿[39]。Petrigliano 等[40]使用了有序 PCL 纳米纤维支架进行大鼠 ACL 重建，12 周后发现骨隧道和关节内区域支架上均有胶原沉积，生物力学检测发现极限载荷与刚度均高于体外支架，但仍明显小于天然韧带。Leong 团队[41]制造了 PCL/COL 有序纤维支架进行了大鼠 ACL 重建，发现体内移植物的初始极限载荷与刚度值分别为天然 ACL 的 13.5% 和 15.7%，术后 16 周增强到 31.3% 和 28.2%。随后使用超高分子 PCL 制作相似的支架进行大鼠 ACL 重建，未进行体外力学性能检测，虽然术后 16 周发现超高分子 PCL 移植物力学强度较普通 PCL 强，但极限载荷和刚度也仅达到天然 ACL 的 41.9% 和 21.3%[42]。综合上述研究发现该类合成多聚物制造的有序纤维支架虽然能够在体内外诱导腱系分化以及 ECM 沉积，但植入后的力学强度较 ACL 仍存在较大差距，需要在结构和成分上进一步优化。
3.2.2 芯鞘结构
韧带存在胶原纤维、纤维束等多级结构，各级纤维束均由相应腱内膜与腱鞘膜包裹，这种芯鞘结构保证了内部纤维结构的紧密有序和完整性，而包膜的胶原网络也增强了韧带整体的力学强度。有学者通过静电纺丝制造了 PLLA 有序纳米纤维垫，并卷为纤维束，将 100 束平行排列的纤维束捆绑后在表面纺丝无序 PLLA 纤维鞘，发现束内纤维紧密相邻且轴向有序排列，成功模拟了分级纤维和芯鞘结构，支架的应力应变曲线存在良好的趾区和线性区，刚度与韧带相仿但抗张强度较低，FBs 可渗入纤维间并表现出良好的增殖活性[43]。Teuschl 团队[13-14]使用脱胶的蚕丝纤维进行分级拧捻和编织，使用管状编织外鞘包裹了内部两股编织绳索，在编织纤维的基础上构建了芯鞘结构支架，极限载荷和刚度分别达到 1 450 N 和 200 N/mm，均在羊 ACL 力学强度范围内，术后 1 年发现关节内支架蚕丝明显减少，大量新生韧带组织长入，而移植物与骨隧道界面处球状新生骨相连，自体血管基质组分的使用未见远期效果。Cai 等[44]则先制造了 PLCL/SF 纳米纤维包裹的 PCL 纤维束，再将该芯鞘结构线针织为 3D 支架，支架极限载荷、弹性模量分别为 77 N、91 MPa，体外显著上调 MSCs 的腱系标记基因，使用该支架对兔髌韧带缺损进行修复，术后 6 月修复组织的组织学和力学表现均强于 PCL 纤维支架，与天然组织相近。由此可见，包有外鞘的分级纤维支架通过模拟天然韧带结构提高了支架完整性和力学强度的同时还支持细胞和组织的长入。
4 多相腱骨界面支架
腱骨界面由肌腱、纤维软骨、钙化纤维软骨以及骨组织连接构成，该组成和结构梯度形成的力学性能差异能够避免应力传导过程中因应力集中造成的组织损伤。界面组织工程的难点在于如何同时再生多种组织类型并恢复其独有的梯度结构和力学特性，而根据仿生性原则设计的多相支架为再生这类复杂组织带来了希望。支架上根据结构或组成差异所划分出的不同区域即为相，如常见的三相腱骨界面支架通常包括韧带相、纤维软骨相和骨相。无机物是骨组织工程中常用的骨引导材料，而生长因子则具备诱导多系分化能力，近期的界面组织工程研究常基于两者的成分梯度构建支架的异质相。
4.1 无机物梯度支架
TCP 因为其固有的骨诱导特性和适宜的降解率成为了骨和界面组织工程中常用的添加材料。一项研究利用 3D 打印技术制造了多孔 PCL（腱区）-管状 PCL/TCP（纤维软骨区）-多孔 PCL/TCP（骨区）三相支架，从骨区到腱区形成了 TCP 梯度，三相均拥有良好的孔隙连通度，分别支持 FBs、骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和成骨细胞的黏附和增殖，软骨诱导培养 21 天后支架纤维软骨区内软骨生成，在植入小鼠皮下 8 周后支架相内分别上调了成腱、软骨、骨标记基因，而 COL-X 的上调进一步明确了钙化软骨形成[19]。另一项研究使用 3D 打印的 PCL/PLGA/β-TCP 支架套绕自体腘绳肌肌腱固定于股骨和胫骨隧道内完成了兔 ACL 重建，形成了支架和自体肌腱之间的 TCP 梯度，术后 12 周可见平滑的腱骨过渡组织，含丰富纤维软骨，骨隧道面积亦显著缩小[20]。更有趣的是，有学者用聚乙二醇凝胶连接了两端的 COL/GAG 与钙化 COL/GAG 材料构成了三相支架，通过优化凝胶的粘弹性过渡过程强化了凝胶韧性，降低了界面支架的应力集中，该界面支架的设计结合了矿物梯度与应力分散机制[45]。
HAp 与 TCP 同属于磷酸钙材料，降解周期更长，具有良好的骨引导性，在界面组织工程的支架设计中应用广泛。Calejo 等[12]设计的三相纤维编织支架分别使用了湿纺 PCL/GEL 有序纤维和 PCL/GEL/HAp 无序纤维从两头编织到中间交汇，人脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs）在高 HAp 浓度的无序纤维区域沉积了丰富的 COL-I，而交汇区域则沉积了 COL-II 和 COL-X，分别提示了骨和软骨基质的合成。另一项研究中发现在整合了 HAp 浓度梯度的脂肪脱细胞支架上，人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs）分别在支架的韧带、软骨、骨相区域沉积了 COL-I、GAG+COL-II 和钙质，与腱骨界面基质组成梯度相似，植入大鼠肩袖损伤处 8 周后形成了成熟的胶原纤维和纤维软骨结构，潮线清晰可见，修复组织的力学强度显著优于对照[46]。
界面支架中无机物梯度的建立均遵循了仿生原则，高浓度区域对应骨相，中间的过渡区对应钙化和非钙化的纤维软骨相，而无钙化区对应韧带相，各相在有无结构梯度的情况下均可不同程度诱导 MSCs 向相应谱系分化并沉积 ECM，在动物体内亦能重建结构成熟的腱骨界面。
4.2 生长因子梯度支架
天然腱骨界面的 ECM 中均存在着有利于各自谱系分化和稳态维持的生化因子环境，所形成的生化梯度为支架的仿生性设计提供了新思路。生长因子可通过直接掺入混合、复合材料或慢病毒基因转染的方式载入支架。在 Han 团队[47-48]的两项界面组织工程研究中，分别通过 LBL 技术在无序 PCL 纤维支架表面覆盖了含有 BMP-7[47]、BMP-2 和 SDF-1α[48]的聚电解质凝胶材料，兔 ACL 重建后 12 周均发现含有生长因子的支架明显促进了骨隧道的新骨形成和骨整合，显著缩小了骨隧道面积，强化了界面连接的生物力学强度。在一项更为复杂的界面支架研究中，将针织蚕丝支架划分三区并分别复合不同材料，使用磷脂酰丝氨酸功能化后将不同生长因子基因整合到相应区域中，具体为 A 区（SF）-B 区（SF/CS/HA+慢病毒 TGF-β3）-C 区（SF/HAp+慢病毒 BMP-2），体外培养 2 周后 BMSCs 在 A、B、C 区分别上调了成腱、成软骨、成骨标记基因以及载入的生长因子基因表达，将该针织网卷为圆柱状支架后（两端由外到内依次为 C、B、A 区）进行兔 ACL 重建，术后 12 周发现基因携带支架形成了典型的骨-软骨-韧带结构界面，特别在外层骨区形成了完整的骨质层，拔出载荷（42 N）显著高于对照，与天然 ACL 相近[15]。
也有研究在支架中同时整合了结构、无机物和生长因子梯度来构建界面支架。如 Jiang 团队[30]在早期研究中分别用 PLGA/HAp/BMP-2 和 PLGA 溶液纺丝了支架的有无序和有序纳米纤维相，支架上 FBs 的碱性磷酸酶表达随 nHA 和 BMP-2 浓度梯度升高而增强，兔 ACL 重建 12 周后发现移植物-骨界面处纤维软骨过渡区域再生，类似天然腱-骨界面结构。该团队在后续的研究中，以相同的方法制造了两相 PLGA 纳米纤维支架，在有序和无序纤维相分别整合了 TGF-β3 和 BMP-2/HAp，在整体支架中呈现反向梯度，无序纤维联合 BMP-2/HAp 梯度协同促进了 BMSCs 的成骨分化梯度，结果与早期研究一致，但 TGF 联合有序纤维的软骨分化效应不明显[49]。
整合了无机物梯度或/和生长因子梯度的多相支架均具备体外诱导 MSCs 向韧带、软骨、骨系不同程度分化的潜能，甚至在动物体内重建了结构成熟的腱骨界面，但界面结构和组成的复杂性也为组织工程中仿生支架的设计和临床转化带来了挑战。
5 生物组织衍生支架
生物组织衍生支架直接来源于组织或器官，通过物理和化学法脱细胞后保留 ECM，支架在结构、组成、功能上较其他类型支架更接近天然组织，且低免疫原性保证了生物相容性。近期有多项研究使用单种或复合体组织制造了脱细胞支架用于肌腱或韧带的组织工程研究，通过细胞再植、力学刺激或材料添加取得了一定效果，但同样存在不足。
有研究显示脱细胞肌腱的纤维平行结构和部分力学性能（抗张强度、刚度、极限应变）与脱细胞前无显著差异[50]。在异种脱细胞肌腱重建兔 ACL 的研究中发现，支架的细胞再植联合力学刺激显著增强了术后移植物的力学强度[51]，而复合 HAp/金纳米颗粒支架可促进宿主组织的再生和重塑[52]，但均存在不同程度的炎症和移植物降解或坏死的情况。在界面组织工程中，脱细胞骨-纤维软骨-肌腱复合组织是具备天然结构和成分梯度的多相支架。Su 等[53]取猪跟腱处的腱骨连接复合体，脱细胞后发现胶原纤维和软骨纤维的结构基本保留，而 COL 和 GAG 部分保留，损失程度因区域而异，抗张强度和弹性模量与人跟腱相似，鼠 BMSCs 在支架上表现出了良好的黏附、渗入和增殖活动，且 2 周后相应区域内分别上调了肌腱和骨标记基因，细胞再植支架重建兔内侧副韧带 8 周后相比单纯脱细胞肌腱显著促进了隧道内骨整合。另一项研究取狗髌骨-髌韧带复合体进行脱细胞，确认了纤维软骨基质以及胶原纤维轴向结构的保留，在拉伸刺激下促进了 BMSCs 的渗入、轴向排列以及腱系分化，但软骨系分化不明显[54]。
Tang 团队[55-58]近年来致力于书样结构脱细胞支架联合细胞片的构建体研究，书样结构即将整块支架切片为书页结构，组织片分离侧为书口，对侧相连部为书脊，该结构有利于支架之间或与细胞片的整合。他们先后分别利用兔骨[55]、纤维软骨[55-56]以及肌腱[57]组织制造了书样脱细胞支架，并在体外明确了支架具备良好的生物相容性和诱导 MSCs 向支架本源组织谱系分化的能力，后联合 MSCs 细胞片分别进行了兔髌骨-膑腱连接和跟腱缺损处的修复，发现修复组织的结构和功能良好。该团队近期又设计了联合脱细胞骨、纤维软骨、肌腱的复合书样支架，支架之间通过书页交叉连接，形成了类似腱骨界面的四个过渡区域，将 BMSCs 细胞片夹入书页间均匀分布，2 周后在相应区域内分别上调了骨、软骨、韧带系标记基因和蛋白的表达，后将该支架/细胞构建体植入兔髌骨-膑腱缺损处，术后 16 周在局部形成了连续的骨-纤维软骨-肌腱界面组织，组织学和生化分析证明了结构与组成的梯度性，界面的力学强度也显著高于对照[58]。
在研究中发现生物组织衍生支架具备良好的生物相容性，因为不同程度保留了原组织 ECM 微环境，具备诱导 MSCs 向支架的本源谱系分化和组织再生的潜力。但该类支架依然存在细胞残留导致免疫炎性反应[51-52]或不同程度的成分丢失[53，56-57]的问题，导致其力学强度和诱导分化能力削弱。有研究通过优化十二烷基硫酸钠的浓度和脱细胞时间，在保证充分细胞脱除的前提下提高了 ECM 成分和生长因子的存留比例，支架表现出了对 MSCs 更显著的诱导分化效应[56]。因此，将来应该在进一步优化脱细胞技术的同时完成对脱细胞支架结构、组成以及力学性能的全面评估。
6 总结与展望
韧带组织工程支架的研究涉及广泛的材料和制造技术，其仿生性体现在通过模仿韧带的组成和宏观、微观结构实现与之相似的力学性能和理化环境，能够早期在体内承受生理负载并促使组织长入，完成从移植物到自体组织的过渡。在动物体内研究中发现该类支架还存在着力学强度、抗疲劳性和组织再生能力不足等问题，而基于复合材料的仿生多相支架依然是将来韧带组织工程支架设计的主要思路，但某些结构和组成上的仿生性很难实现。生物组织衍生支架的出现为支架的设计带来了简化方案，其在组成和结构上的固有仿生性使之具备了良好的生物诱导环境和力学性能，包括韧带的抗蠕变以及界面的应力分散能力，但脱细胞后基质的成分损失和体内炎症导致的基质降解均削弱了支架性能。未来韧带组织工程支架的研究方向可以利用生物组织衍生支架的仿生性优势，根据需要整合不同结构的天然、合成多聚物或无机材料构建力学、生物学性能强化的多相支架，再联合力学刺激、生长因子、MSCs 来促进组织再生和改善炎性环境，同步实现关节区域内韧带和隧道内腱骨界面的重建。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。