阿尔茨海默病（AD）是一种慢性中枢神经退行性疾病。AD 的主要病理特征为淀粉样蛋白 β 低聚物（AβOs）在胞外沉积形成老年斑，以及 tau 蛋白过度磷酸化在胞内积聚形成神经纤维缠结。本文提出了一种基于神经网络传感芯片的 AD 体外病理模型及其实时动态分析方法，在微电极阵列芯片上培养海马神经元并形成网络，使用 AβOs 诱导海马神经元构造 AD 体外模型，同时记录到锥体神经元和中间神经元两种放电模式，利用空间发放图谱和通道间的互相关系数验证了病理模型中神经元网络间信息连接的退化。该生物传感器能够从电信号上反应 AβOs 对神经网络的毒性反应以及神经元网络之间的信号传递功能，有望成为体外 AD 病理网络模型研究的一种新手段。
引用本文： 高凡, 高克强, 贺川江, 刘梦雪, 胡燕婕, 应可净, 万浩, 王平. 基于神经网络芯片的阿尔茨海默病体外病理模型及其实时动态分析. 生物医学工程学杂志, 2019, 36(6): 893-901. doi: 10.7507/1001-5515.201902014 复制
引言
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种慢性中枢神经退行性疾病，其主要临床症状为短期记忆障碍和认知障碍等。随着当今社会人口老龄化程度日益严峻，AD 的高发病率和高致残率已成为影响人类健康的一个重要问题，而目前对 AD 的诊断和治疗手段仍十分有限。AD 的主要病理特征为淀粉样蛋白 β 低聚物（amyloid-β oligomers，AβOs）胞外沉积形成老年斑，以及 tau 蛋白过度磷酸化胞内积聚形成神经纤维缠结[1]。淀粉样蛋白由 39～43 个氨基酸组成，这些氨基酸由淀粉样前体蛋白生成[2]。AβOs 是淀粉样蛋白聚集物的主要形式，突触功能障碍和认知功能减退都与 AβOs 对突触的毒性作用密切相关[3]。AβOs 打开了突触上的电压门控钙通道，促进钙离子大量内流，最终导致轴突运输（如脑源性神经营养因子等物质）的功能受到损伤[4]。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体是兴奋性突触后膜上离子型谷氨酸受体的主要类型[5]，AβOs 可与神经元表面含有 NMDA 受体的蛋白相结合并影响下游通路，从而诱导突触毒性效应[6]。近年来，一些研究者通过 AβOs 诱导神经元或器官型脑片建立了 AD 体外病理模型[7-8]，用于研究突触可塑性和药物机制等，为后续研究提供了基础和思路。
除了淀粉样蛋白对神经元造成损伤外，过度磷酸化的 tau 蛋白也发挥着毒性作用。tau 蛋白是一种结合神经元轴突微管的相关蛋白，能稳定微管并进行不同类型的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等。异常的超磷酸化可诱导 tau 蛋白构象变化和聚集，从而形成神经纤维缠结[9]。在 AD 模型的神经元网络中，高度磷酸化的 tau 蛋白（phosphorylated tau，p-tau）从微管中分离，导致细胞骨架的稳定性下降[10-11]。此外，病理性的 tau 蛋白可通过其 N 末端序列与突触小泡结合，最终导致突触前功能中断[12]。
膜片钳和功能性光学成像等技术常被应用于研究离子通道和神经电活动。膜片钳是电生理记录的金标准，具有很高的灵敏度和特异性，但其通道数量有限，实验要求高，难以揭示神经元网络特征[13-15]。钙离子成像可以描述多个单细胞的活动映射，但通常受到一些限制，如时间分辨率低、无法长时间连续在线记录等[16]。微电极阵列（microelectrode array，MEA）能够记录大量跨膜离子传输所产生的细胞外膜动作电位，已成为研究神经元网络电生理的新平台[17-19]，并具有多通道、时间分辨率高、可长期记录和同步刺激等优点[20]。如 Amin 等[21]使用一种互补金属氧化物半导体多电极阵列来检测经 AβOs 诱导后神经网络的早期活动变化和神经毒性影响。然而，他们并没有研究 AβOs 对两类神经元的不同影响，以及通道间的网络通信与时间关联性。为了克服这些局限性，一种基于神经网络传感芯片的 AD 体外病理模型及其实时动态分析方法被提出，通过设计制作 MEA 芯片，在修饰芯片表面后培养海马神经元并形成网络，使用 AβOs 诱导建立 AD 体外模型。基于该芯片，本文期望达到能够多位点、长时间、实时动态地测量神经元电活动和网络通信的目的，进一步利用空间发放图谱和通道间互相关性评估神经元网络的信号传递功能，为今后体外 AD 病理网络模型研究提供一种新的手段。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
本文所用材料包括：淀粉样蛋白（Thermo Fisher 公司，美国）；胰酶（Thermo Fisher 公司，美国）；杜氏改良培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher 公司，美国）；神经基础培养基（Thermo Fisher 公司，美国）；无血清培养基 B27（Thermo Fisher 公司，美国）；谷氨酰胺（Thermo Fisher 公司，美国）；青霉素—链霉素（Thermo Fisher 公司，美国）；阿糖胞苷（Sigma 公司，美国）；六氟-2-丙醇（Sigma 公司，美国）；胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；层粘连蛋白（Sigma 公司，美国）；多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，中国）；聚乙二醇辛基苯基醚 Triton X-100（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国）；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）（国药集团化学试剂有限公司，中国）；山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；微管相关蛋白 2（microtubule-associated proteins 2，MAP2）一抗（Proteintech Group，美国）；p-tau 蛋白一抗（Cell Signaling Technology，美国）；Alexa Fluor 二抗（Beyotime Biotechnology，中国）。
本文所用设备包括：二氧化碳培养箱（Heracell 150i，Thermo Fisher 公司，美国）；离心机（SpeedVac，Thermo Fisher 公司，美国）；激光共聚焦荧光显微镜（AiR，Nikon 公司，日本）；MEA 记录系统（Classic MEA-System，Multi Channel Systems 公司，德国）。
1.2 MEA芯片与记录系统
MEA 芯片由多通道组成，用于大数据采集并记录来自神经元网络的电活动信号。MEA 系统模式示意图如图1 所示，神经元生长在芯片表面后，自发或兴奋性刺激产生胞内外 K+、Na+离子的大量交换，产生动作电位并改变胞外膜电位。图1 中 Z 为电极—电解液界面双电层阻抗，此处电压接近细胞膜附近的电压，细胞膜电位变化直接影响该点电压。信号由电极点记录后传输至放大器，再经数据采集卡转换后传输至个人计算机（personal computer，PC）进行显示和分析。系统包含温度控制模块和刺激模块，对 MEA 芯片控温在 37℃，并可编写不同幅值、频率的刺激序列施加在任一电极点上，并同步记录所有通道的刺激后响应。
图1
MEA 检测系统原理图
Figure1.
The schematic diagram of the MEA detection system
MEA 芯片采用微机电系统工艺制作，加工流程如图2 所示，具体步骤为：① 选取四英寸硅片（厚约 450 μm），将一层 30 nm 铬层和一层 300 nm 金层分别沉积到玻璃基底上，作为黏附层和电极层；②～⑤ 使用光蚀刻技术蚀刻出电极位点和引线的布局；⑥ 使用等离子増强型化学气相沉积（plasma-enhanced chemical vapor deposition，PECVD）在芯片表面沉积一层 1 μm 的 Si3N4 作为纯化层；⑦～⑨ 使用反应离子刻蚀技术（reaction ion etching，RIE）暴露出电极和焊盘对应处的 Si3N4，之后使用 KOH 溶液将 Si3N4 刻蚀掉，露出电极位点和焊盘并清洗光刻胶；⑩ 使用计时安培法在 MEA 电极表面电镀铂黑，完成 MEA 芯片加工。该 MEA 芯片共有 60 个工作电极，成 8×8 方形阵列排布，单个电极直径为 30 μm，电极间距为 200 μm，对每个电极点按从上到下、从左到右的顺序进行编号（1～60），以便于数据分析与结果展示。电镀铂黑后，电极点比表面积增加，电极阻抗降低，以提高信噪比。使用金线将芯片上的焊盘和印制电路板（printed circuit board，PCB）上的接口连接，使用生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）制作直径 1.5 cm、高度 1 cm 的腔室固定在芯片上，用于细胞培养。为评估电极表面特性，本文采用电化学交流阻抗谱验证 MEA 电极电镀铂黑之后的效果。选择 MEA 芯片上的任一通道为工作电极，外置银—氯化银电极为参比电极，在培养腔中加入 pH 值 7.4 的磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline, PBS）溶液，外加振幅为 5 mV 的正弦激励，评估 MEA 电极点阻抗谱变化。结果显示，裸金电极的阻抗幅值高达 5～10 kΩ；电镀铂黑后，阻抗幅值降至 1 kΩ 以下。当使用 MEA 芯片记录电生理信号时，裸金电极基线幅度达上百微伏，且极易受外界干扰，而电镀铂黑后，基线幅值减小至 40 μV 以内且基线平稳。
图2
MEA 芯片加工流程
Figure2.
The general process for MEA chip fabrication
1.3 AβOs的制备
打开装有冷冻淀粉样蛋白的肽瓶，在室温下平衡 30 min。将淀粉样蛋白重新悬浮在低温的六氟-2-丙醇中，振荡几秒后迅速将该混合溶液等分为三个聚丙烯小瓶。在室温下孵育 2 h，以使淀粉样蛋白单体化。在室温下使用离心机（800 g）浓缩溶液，直到在小瓶底部观察到清晰的肽膜。此后，通过二甲基亚砜溶液使肽膜重新悬浮以获得 5 mmol/L 浓度的母液，并将小瓶密封并在 − 20℃ 下储存。实验前，使用 100 μL 的 0.01 mol/L 的 PBS 稀释母液，振荡 30 s 后在 4℃ 环境下孵育 12 h。当诱导细胞时，将溶液加入神经元培养基中，并确保最终浓度为 500 nmol/L。
1.4 海马神经元培养
所有涉及动物的实验均按照浙江大学动物实验委员会的伦理准则进行，且已通过动物伦理审查委员会的审查。妊娠 SD 大鼠来自浙江省医学科学院。为了提高 MEA 芯片的生物相容性，使用多聚赖氨酸和层粘连蛋白混合溶液在 4℃ 下包被芯片表面 12 h。取胎鼠的海马组织，在 37℃ 下轻轻切碎组织并用 0.25 % 胰蛋白酶消化 15 min。分离出的原代海马神经元细胞，在 MEA 芯片表面以 5×105个/孔的密度接种，培养液为含 10 % 马血清的 DMEM。同时，在 24 孔板上以 1×104个/cm2的密度接种，用于后期进行免疫荧光成像。芯片和 24 孔板均在 37℃ 含 5% 二氧化碳的培养箱中保存。接种 4 h 后，用神经基础培养基（含有 2 % B27、1 % 谷氨酰胺和 0.4 % 青霉素—链霉素）代替接种培养基。在培养 3 d 后，加入终浓度为 2.5 μm 的阿糖胞苷，每隔 2～3 d 进行半量换液。在培养的第 13 d 使用 AβOs 诱导神经元，并使用 MEA 记录神经元网络的电生理变化。诱导 12 h 后，对 24 孔板中的细胞进行免疫荧光染色。
1.5 免疫荧光染色
24 孔板中的细胞在室温下使用 4 % 多聚甲醛固定 30 min 后，使用 PBS 洗涤 3 次。使用 0.15 % Triton X-100 渗透 15 min，并在 37℃ 下用 1 % BSA 封闭液培养 30 min。然后在 4℃ 下使用 MAP2 和 p-tau 蛋白的一级抗体孵育 12 h，接着在室温下使用 Alexa Fluor 二级抗体孵育 2 h，最后使用 4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色法对细胞核染色并贴于玻片上。用 1 % Triton X-100、5 % 山羊血清和 1 % BSA 溶液稀释 MAP2 蛋白和 p-tau 蛋白一抗，稀释率分别为 1∶250 和 1∶200。使用 PBS 稀释 Alexa Fluor 二抗，稀释率为 1∶500。利用激光共聚焦荧光显微镜对荧光图像进行了采集。
1.6 软件与数据分析
本文使用 MEA 记录软件 MC_Rack（Multi Channel Systems 公司, 德国）记录和显示 MEA 数据。使用 MEA 数据处理软件 Offline Sorter V4（Plexon 公司, 美国）和 NeuroExplorer 5（Plexon 公司, 美国）将原始信号经 Bessel 4 阶高通滤波器（截止频率：250 Hz）滤波后，选取信噪比大于 3 的通道作为有效信号通道，计算各有效信号通道的正负峰间隔、发放率和峰峰值，对自发动作电位波形进行分类。本研究中的所有数据均以均值±标准差表示。使用 t 检验评估组间差异的统计学意义，P < 0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 海马神经元网络生长与免疫荧光成像
MEA 芯片及海马神经元网络在芯片表面和电极点上的生长状况如图3 所示。显微镜下可观察到电极点阵列的排布，海马神经元培养 14 d 后，可观察到胞体、轴突和树突生长在单个电极点表面，且海马神经元已相互连接形成网络，覆盖在 MEA 芯片表面，表明 MEA 芯片表面具有良好的生物相容性，可在电极上检测到有效信号并分析神经元网络通信状态。
图3
MEA 芯片及海马神经元网络生长状况
Figure3.
Physical map of MEA chip and growth state of hippocampal neuron network
为了验证 AβOs 对神经元网络的影响，在体外培养 13 d 后，本文通过对树突的 MAP2 和 p-tau 蛋白进行标记来观察细胞形态和结构的变化，海马神经元免疫荧光成像分析如图4 所示。由 MAP2 的免疫荧光染色显示，经 AβOs 诱导 12 h 后，神经元细胞出现了轴突变性和树突受损，原本光滑连续的树突断裂为片段或斑点。此外，由 p-tau 蛋白的免疫荧光染色显示，AβOs 诱导 12 h 后，部分神经元细胞的 p-tau 蛋白含量显著增加（白色箭头），这证实了部分 tau 蛋白发生过度磷酸化并聚集，这与 AD 退化神经元中观察到的现象相似。
图4
海马神经元免疫荧光成像分析
Figure4.
Immunofluorescence image analysis of hippocampal neuron
2.2 海马神经元发放模式
当海马神经元网络在 MEA 芯片上生长达 13 d 时，记录海马神经元自发放电状态下的胞外信号并进行特征提取与分类。选取信噪比较高的通道 23 和通道 76 为示例，记录到典型有效原始信号如图5 所示，垂直比例尺代表幅值，水平比例尺代表时间。由图可知，信号基线小于 20 μV，锋电位幅度大于 100 μV，信噪比大于 5，说明 MEA 芯片能有效记录神经元的胞外电位信号。选择三倍 sigma 作为阈值检测每个通道的峰值，提取波形、正负峰间期、峰峰值、发放率等特征参数，分类得到 4 种锋电位。由于中间神经元间正负峰间期一般小于 500 μs，而锥体神经元的正负峰间期均大于 700 μs[22]，因此 3 种锋电位来源于中间神经元的放电，另一种锋电位由锥体神经元放电产生。提取出的不同神经元发放的锋电位波形如图5 所示。生长在电极点上的神经元胞体或轴突、树突位置与数量不同，故在同一电极点上可能记录到同一种神经元的不同发放波形。由 AβOs 诱导后，树突棘的数量逐渐减少，突触蛋白丢失增多，神经递质受体表面表达受损，同时伴随着兴奋性突触后电流的减少和突触可塑性的降低。如图6 所示显示了经 AβOs 诱导 12 h 与 24 h 后，不同神经元发放锋电位归一化后的幅值和频率的变化。结果显示，幅值和频率均明显降低，其中诱导 12 h 和 24 h 的发放幅值和频率相较于自发放其差异均有统计学意义（P < 0.05）；且诱导 24 h 的发放频率相较于 12 h，其差异也具有统计学意义（P < 0.05）。
图5
海马神经元发放有效信号与锋电位分类
Figure5.
Effective signals of hippocampal neurons firing and spike classification
图6
AβOs诱导前后发放幅值与频率变化统计图（n = 9，n 表 示有效信号通道数）*P < 0.05
Figure6.
Statistical chart of amplitude and frequency changing before and after treatment with AβOs (n = 9, n indicates the number of channels with effective signals) *P < 0.05
2.3 海马神经元网络发放图谱
利用 MEA 空间多位点同时记录的特性，绘制海马神经元网络发放图谱，观察诱导前后的变化，以检测神经退行性变、网络连接和通信中断等 AD 模型的主要病理改变。MEA 芯片同时记录到的神经元网络多位点电信号如图7 所示。自发放电状态中，60 个通道中 34 个通道记录到基线信号，26 个通道记录海马神经元网络的有效放电信号。其中，23 个通道记录到中间神经元的发放锋电位（橙色、蓝色、紫色），6 个通道记录的锋电位来源于锥体神经元（绿色），且有 7 个通道同时记录到两类锋电位发放，1 个通道同时记录到三类锋电位发放，神经元网络生长状态良好，且 MEA 阵列可有效记录到神经元网络中多位点的发放信号。
图7
空间多位点海马神经元网络发放图谱
Figure7.
Spatial multi-site hippocampal neuronal network firing map
AβOs 诱导海马神经元网络 12 h 后，有效信号通道数下降为 12，剩余有效信号通道的锋电位发放幅值和频率均减少。诱导 24 h 后，仅剩 6 个通道含有有效信号，且发放频率幅值明显降低。此外，12 h 后，锥体神经元发放通道仅存 3 个，24 h 后锥体神经元放电完全消失，仅剩下中间神经元发放。这是由于锥体神经元是 AD 发病机制和认知功能障碍的核心[23]，神经纤维缠结的形成和淀粉样前体蛋白代谢失调和退化多发于锥体神经元，使得锥体神经元的电生理活性受到更严重的影响。
2.4 神经元网络关联性分析
基于 MEA 的神经元网络芯片还可挖掘各点信号之间的关系和特点，并能考察细胞与细胞信息之间的同步性和平行关系。3 组相近通道神经元发放的互相关分析如图8 所示，横轴为锋电位间隔时间，纵轴为锋电位数量，该图反应了两个通道神经元发放之间时间的关联性。如果互相关直方图平坦无规律，则两个放电序列视为各自独立的过程；如果互相关函数在 0 时刻出现峰值，则两个神经元有出现同步放电的趋势，两者存在共同输入或突触连接，其他形状则为相互促进或者抑制关系等。
图8
海马神经元网络通道间互相关性分析
Figure8.
Cross-correlation analysis of hippocampal neuronal network between different channels
由自然发放状态下各组通道之间自相关分析可知，通道 23 vs. 通道 44、通道 44 vs. 通道 76 记录到的神经元发放同步但不存在明显不应期，说明两个电极点可能记录到不同神经元的同步发放，而通道 73 vs. 通道 87 记录到的神经元发放同步且存在不应期，说明两个电极点记录到同一个神经元的发放。
AβOs 诱导 12 h 后，通道 23 vs. 通道 44、通道 44 vs. 通道 76 仍有同步发放，但相关性明显减弱，通道 73 vs. 通道 87 相关性消失。诱导 24 h 后，除了通道 44 vs. 通道 76 仍有微弱的同步发放，其余两组通道之间均无相关性。AβOs 诱导后导致突触可塑性降低乃至突触丢失，使突触的信息传输、加工，神经递质的储存、释放、再摄取，以及递质、受体、功能蛋白间相互作用的丧失，最终导致海马神经元网络之间的通信中断、信号与营养因子的传递受阻。
3 结语
本文提出了一种基于神经网络传感芯片的 AD 体外病理模型及其实时动态分析方法，在 MEA 芯片上培养海马神经元并形成网络，使用 AβOs 诱导 AD 体外模型，同时测量神经元网络的退行性生物电活动变化，实验结果显示该方法具有高通量、长时间、实时动态监测等优点。通过对锋电位信号的分析，提取出正负尖峰间隔、发放率、峰峰值等多个特征参数，并对锋电位进行了分类。记录了 AβOs 诱导后，中间神经元和锥体神经元在 24 h 内的发放模式，12 h 后发放幅值与频率逐渐减弱，24 h 后锥体神经元放电消失。AβOs 诱导可导致渐进性神经元网络功能障碍，通过空间多位点发放图谱和通道间的互相关性分析，评估神经元网络连通性的退化。本文实验结果证明该方法能够检测到 AβOs 的神经毒性作用，并分析验证了神经元网络通信功能的受损，今后或可成为一种高效实用的研究体外 AD 病理网络模型的新型技术。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种慢性中枢神经退行性疾病，其主要临床症状为短期记忆障碍和认知障碍等。随着当今社会人口老龄化程度日益严峻，AD 的高发病率和高致残率已成为影响人类健康的一个重要问题，而目前对 AD 的诊断和治疗手段仍十分有限。AD 的主要病理特征为淀粉样蛋白 β 低聚物（amyloid-β oligomers，AβOs）胞外沉积形成老年斑，以及 tau 蛋白过度磷酸化胞内积聚形成神经纤维缠结[1]。淀粉样蛋白由 39～43 个氨基酸组成，这些氨基酸由淀粉样前体蛋白生成[2]。AβOs 是淀粉样蛋白聚集物的主要形式，突触功能障碍和认知功能减退都与 AβOs 对突触的毒性作用密切相关[3]。AβOs 打开了突触上的电压门控钙通道，促进钙离子大量内流，最终导致轴突运输（如脑源性神经营养因子等物质）的功能受到损伤[4]。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体是兴奋性突触后膜上离子型谷氨酸受体的主要类型[5]，AβOs 可与神经元表面含有 NMDA 受体的蛋白相结合并影响下游通路，从而诱导突触毒性效应[6]。近年来，一些研究者通过 AβOs 诱导神经元或器官型脑片建立了 AD 体外病理模型[7-8]，用于研究突触可塑性和药物机制等，为后续研究提供了基础和思路。
除了淀粉样蛋白对神经元造成损伤外，过度磷酸化的 tau 蛋白也发挥着毒性作用。tau 蛋白是一种结合神经元轴突微管的相关蛋白，能稳定微管并进行不同类型的翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等。异常的超磷酸化可诱导 tau 蛋白构象变化和聚集，从而形成神经纤维缠结[9]。在 AD 模型的神经元网络中，高度磷酸化的 tau 蛋白（phosphorylated tau，p-tau）从微管中分离，导致细胞骨架的稳定性下降[10-11]。此外，病理性的 tau 蛋白可通过其 N 末端序列与突触小泡结合，最终导致突触前功能中断[12]。
膜片钳和功能性光学成像等技术常被应用于研究离子通道和神经电活动。膜片钳是电生理记录的金标准，具有很高的灵敏度和特异性，但其通道数量有限，实验要求高，难以揭示神经元网络特征[13-15]。钙离子成像可以描述多个单细胞的活动映射，但通常受到一些限制，如时间分辨率低、无法长时间连续在线记录等[16]。微电极阵列（microelectrode array，MEA）能够记录大量跨膜离子传输所产生的细胞外膜动作电位，已成为研究神经元网络电生理的新平台[17-19]，并具有多通道、时间分辨率高、可长期记录和同步刺激等优点[20]。如 Amin 等[21]使用一种互补金属氧化物半导体多电极阵列来检测经 AβOs 诱导后神经网络的早期活动变化和神经毒性影响。然而，他们并没有研究 AβOs 对两类神经元的不同影响，以及通道间的网络通信与时间关联性。为了克服这些局限性，一种基于神经网络传感芯片的 AD 体外病理模型及其实时动态分析方法被提出，通过设计制作 MEA 芯片，在修饰芯片表面后培养海马神经元并形成网络，使用 AβOs 诱导建立 AD 体外模型。基于该芯片，本文期望达到能够多位点、长时间、实时动态地测量神经元电活动和网络通信的目的，进一步利用空间发放图谱和通道间互相关性评估神经元网络的信号传递功能，为今后体外 AD 病理网络模型研究提供一种新的手段。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
本文所用材料包括：淀粉样蛋白（Thermo Fisher 公司，美国）；胰酶（Thermo Fisher 公司，美国）；杜氏改良培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（Thermo Fisher 公司，美国）；神经基础培养基（Thermo Fisher 公司，美国）；无血清培养基 B27（Thermo Fisher 公司，美国）；谷氨酰胺（Thermo Fisher 公司，美国）；青霉素—链霉素（Thermo Fisher 公司，美国）；阿糖胞苷（Sigma 公司，美国）；六氟-2-丙醇（Sigma 公司，美国）；胰蛋白酶（Sigma 公司，美国）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；层粘连蛋白（Sigma 公司，美国）；多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，中国）；聚乙二醇辛基苯基醚 Triton X-100（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国）；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）（国药集团化学试剂有限公司，中国）；山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；微管相关蛋白 2（microtubule-associated proteins 2，MAP2）一抗（Proteintech Group，美国）；p-tau 蛋白一抗（Cell Signaling Technology，美国）；Alexa Fluor 二抗（Beyotime Biotechnology，中国）。
本文所用设备包括：二氧化碳培养箱（Heracell 150i，Thermo Fisher 公司，美国）；离心机（SpeedVac，Thermo Fisher 公司，美国）；激光共聚焦荧光显微镜（AiR，Nikon 公司，日本）；MEA 记录系统（Classic MEA-System，Multi Channel Systems 公司，德国）。
1.2 MEA芯片与记录系统
MEA 芯片由多通道组成，用于大数据采集并记录来自神经元网络的电活动信号。MEA 系统模式示意图如图1 所示，神经元生长在芯片表面后，自发或兴奋性刺激产生胞内外 K+、Na+离子的大量交换，产生动作电位并改变胞外膜电位。图1 中 Z 为电极—电解液界面双电层阻抗，此处电压接近细胞膜附近的电压，细胞膜电位变化直接影响该点电压。信号由电极点记录后传输至放大器，再经数据采集卡转换后传输至个人计算机（personal computer，PC）进行显示和分析。系统包含温度控制模块和刺激模块，对 MEA 芯片控温在 37℃，并可编写不同幅值、频率的刺激序列施加在任一电极点上，并同步记录所有通道的刺激后响应。
图1
MEA 检测系统原理图
Figure1.
The schematic diagram of the MEA detection system
MEA 芯片采用微机电系统工艺制作，加工流程如图2 所示，具体步骤为：① 选取四英寸硅片（厚约 450 μm），将一层 30 nm 铬层和一层 300 nm 金层分别沉积到玻璃基底上，作为黏附层和电极层；②～⑤ 使用光蚀刻技术蚀刻出电极位点和引线的布局；⑥ 使用等离子増强型化学气相沉积（plasma-enhanced chemical vapor deposition，PECVD）在芯片表面沉积一层 1 μm 的 Si3N4 作为纯化层；⑦～⑨ 使用反应离子刻蚀技术（reaction ion etching，RIE）暴露出电极和焊盘对应处的 Si3N4，之后使用 KOH 溶液将 Si3N4 刻蚀掉，露出电极位点和焊盘并清洗光刻胶；⑩ 使用计时安培法在 MEA 电极表面电镀铂黑，完成 MEA 芯片加工。该 MEA 芯片共有 60 个工作电极，成 8×8 方形阵列排布，单个电极直径为 30 μm，电极间距为 200 μm，对每个电极点按从上到下、从左到右的顺序进行编号（1～60），以便于数据分析与结果展示。电镀铂黑后，电极点比表面积增加，电极阻抗降低，以提高信噪比。使用金线将芯片上的焊盘和印制电路板（printed circuit board，PCB）上的接口连接，使用生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）制作直径 1.5 cm、高度 1 cm 的腔室固定在芯片上，用于细胞培养。为评估电极表面特性，本文采用电化学交流阻抗谱验证 MEA 电极电镀铂黑之后的效果。选择 MEA 芯片上的任一通道为工作电极，外置银—氯化银电极为参比电极，在培养腔中加入 pH 值 7.4 的磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline, PBS）溶液，外加振幅为 5 mV 的正弦激励，评估 MEA 电极点阻抗谱变化。结果显示，裸金电极的阻抗幅值高达 5～10 kΩ；电镀铂黑后，阻抗幅值降至 1 kΩ 以下。当使用 MEA 芯片记录电生理信号时，裸金电极基线幅度达上百微伏，且极易受外界干扰，而电镀铂黑后，基线幅值减小至 40 μV 以内且基线平稳。
图2
MEA 芯片加工流程
Figure2.
The general process for MEA chip fabrication
1.3 AβOs的制备
打开装有冷冻淀粉样蛋白的肽瓶，在室温下平衡 30 min。将淀粉样蛋白重新悬浮在低温的六氟-2-丙醇中，振荡几秒后迅速将该混合溶液等分为三个聚丙烯小瓶。在室温下孵育 2 h，以使淀粉样蛋白单体化。在室温下使用离心机（800 g）浓缩溶液，直到在小瓶底部观察到清晰的肽膜。此后，通过二甲基亚砜溶液使肽膜重新悬浮以获得 5 mmol/L 浓度的母液，并将小瓶密封并在 − 20℃ 下储存。实验前，使用 100 μL 的 0.01 mol/L 的 PBS 稀释母液，振荡 30 s 后在 4℃ 环境下孵育 12 h。当诱导细胞时，将溶液加入神经元培养基中，并确保最终浓度为 500 nmol/L。
1.4 海马神经元培养
所有涉及动物的实验均按照浙江大学动物实验委员会的伦理准则进行，且已通过动物伦理审查委员会的审查。妊娠 SD 大鼠来自浙江省医学科学院。为了提高 MEA 芯片的生物相容性，使用多聚赖氨酸和层粘连蛋白混合溶液在 4℃ 下包被芯片表面 12 h。取胎鼠的海马组织，在 37℃ 下轻轻切碎组织并用 0.25 % 胰蛋白酶消化 15 min。分离出的原代海马神经元细胞，在 MEA 芯片表面以 5×105个/孔的密度接种，培养液为含 10 % 马血清的 DMEM。同时，在 24 孔板上以 1×104个/cm2的密度接种，用于后期进行免疫荧光成像。芯片和 24 孔板均在 37℃ 含 5% 二氧化碳的培养箱中保存。接种 4 h 后，用神经基础培养基（含有 2 % B27、1 % 谷氨酰胺和 0.4 % 青霉素—链霉素）代替接种培养基。在培养 3 d 后，加入终浓度为 2.5 μm 的阿糖胞苷，每隔 2～3 d 进行半量换液。在培养的第 13 d 使用 AβOs 诱导神经元，并使用 MEA 记录神经元网络的电生理变化。诱导 12 h 后，对 24 孔板中的细胞进行免疫荧光染色。
1.5 免疫荧光染色
24 孔板中的细胞在室温下使用 4 % 多聚甲醛固定 30 min 后，使用 PBS 洗涤 3 次。使用 0.15 % Triton X-100 渗透 15 min，并在 37℃ 下用 1 % BSA 封闭液培养 30 min。然后在 4℃ 下使用 MAP2 和 p-tau 蛋白的一级抗体孵育 12 h，接着在室温下使用 Alexa Fluor 二级抗体孵育 2 h，最后使用 4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色法对细胞核染色并贴于玻片上。用 1 % Triton X-100、5 % 山羊血清和 1 % BSA 溶液稀释 MAP2 蛋白和 p-tau 蛋白一抗，稀释率分别为 1∶250 和 1∶200。使用 PBS 稀释 Alexa Fluor 二抗，稀释率为 1∶500。利用激光共聚焦荧光显微镜对荧光图像进行了采集。
1.6 软件与数据分析
本文使用 MEA 记录软件 MC_Rack（Multi Channel Systems 公司, 德国）记录和显示 MEA 数据。使用 MEA 数据处理软件 Offline Sorter V4（Plexon 公司, 美国）和 NeuroExplorer 5（Plexon 公司, 美国）将原始信号经 Bessel 4 阶高通滤波器（截止频率：250 Hz）滤波后，选取信噪比大于 3 的通道作为有效信号通道，计算各有效信号通道的正负峰间隔、发放率和峰峰值，对自发动作电位波形进行分类。本研究中的所有数据均以均值±标准差表示。使用 t 检验评估组间差异的统计学意义，P < 0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 海马神经元网络生长与免疫荧光成像
MEA 芯片及海马神经元网络在芯片表面和电极点上的生长状况如图3 所示。显微镜下可观察到电极点阵列的排布，海马神经元培养 14 d 后，可观察到胞体、轴突和树突生长在单个电极点表面，且海马神经元已相互连接形成网络，覆盖在 MEA 芯片表面，表明 MEA 芯片表面具有良好的生物相容性，可在电极上检测到有效信号并分析神经元网络通信状态。
图3
MEA 芯片及海马神经元网络生长状况
Figure3.
Physical map of MEA chip and growth state of hippocampal neuron network
为了验证 AβOs 对神经元网络的影响，在体外培养 13 d 后，本文通过对树突的 MAP2 和 p-tau 蛋白进行标记来观察细胞形态和结构的变化，海马神经元免疫荧光成像分析如图4 所示。由 MAP2 的免疫荧光染色显示，经 AβOs 诱导 12 h 后，神经元细胞出现了轴突变性和树突受损，原本光滑连续的树突断裂为片段或斑点。此外，由 p-tau 蛋白的免疫荧光染色显示，AβOs 诱导 12 h 后，部分神经元细胞的 p-tau 蛋白含量显著增加（白色箭头），这证实了部分 tau 蛋白发生过度磷酸化并聚集，这与 AD 退化神经元中观察到的现象相似。
图4
海马神经元免疫荧光成像分析
Figure4.
Immunofluorescence image analysis of hippocampal neuron
2.2 海马神经元发放模式
当海马神经元网络在 MEA 芯片上生长达 13 d 时，记录海马神经元自发放电状态下的胞外信号并进行特征提取与分类。选取信噪比较高的通道 23 和通道 76 为示例，记录到典型有效原始信号如图5 所示，垂直比例尺代表幅值，水平比例尺代表时间。由图可知，信号基线小于 20 μV，锋电位幅度大于 100 μV，信噪比大于 5，说明 MEA 芯片能有效记录神经元的胞外电位信号。选择三倍 sigma 作为阈值检测每个通道的峰值，提取波形、正负峰间期、峰峰值、发放率等特征参数，分类得到 4 种锋电位。由于中间神经元间正负峰间期一般小于 500 μs，而锥体神经元的正负峰间期均大于 700 μs[22]，因此 3 种锋电位来源于中间神经元的放电，另一种锋电位由锥体神经元放电产生。提取出的不同神经元发放的锋电位波形如图5 所示。生长在电极点上的神经元胞体或轴突、树突位置与数量不同，故在同一电极点上可能记录到同一种神经元的不同发放波形。由 AβOs 诱导后，树突棘的数量逐渐减少，突触蛋白丢失增多，神经递质受体表面表达受损，同时伴随着兴奋性突触后电流的减少和突触可塑性的降低。如图6 所示显示了经 AβOs 诱导 12 h 与 24 h 后，不同神经元发放锋电位归一化后的幅值和频率的变化。结果显示，幅值和频率均明显降低，其中诱导 12 h 和 24 h 的发放幅值和频率相较于自发放其差异均有统计学意义（P < 0.05）；且诱导 24 h 的发放频率相较于 12 h，其差异也具有统计学意义（P < 0.05）。
图5
海马神经元发放有效信号与锋电位分类
Figure5.
Effective signals of hippocampal neurons firing and spike classification
图6
AβOs诱导前后发放幅值与频率变化统计图（n = 9，n 表 示有效信号通道数）*P < 0.05
Figure6.
Statistical chart of amplitude and frequency changing before and after treatment with AβOs (n = 9, n indicates the number of channels with effective signals) *P < 0.05
2.3 海马神经元网络发放图谱
利用 MEA 空间多位点同时记录的特性，绘制海马神经元网络发放图谱，观察诱导前后的变化，以检测神经退行性变、网络连接和通信中断等 AD 模型的主要病理改变。MEA 芯片同时记录到的神经元网络多位点电信号如图7 所示。自发放电状态中，60 个通道中 34 个通道记录到基线信号，26 个通道记录海马神经元网络的有效放电信号。其中，23 个通道记录到中间神经元的发放锋电位（橙色、蓝色、紫色），6 个通道记录的锋电位来源于锥体神经元（绿色），且有 7 个通道同时记录到两类锋电位发放，1 个通道同时记录到三类锋电位发放，神经元网络生长状态良好，且 MEA 阵列可有效记录到神经元网络中多位点的发放信号。
图7
空间多位点海马神经元网络发放图谱
Figure7.
Spatial multi-site hippocampal neuronal network firing map
AβOs 诱导海马神经元网络 12 h 后，有效信号通道数下降为 12，剩余有效信号通道的锋电位发放幅值和频率均减少。诱导 24 h 后，仅剩 6 个通道含有有效信号，且发放频率幅值明显降低。此外，12 h 后，锥体神经元发放通道仅存 3 个，24 h 后锥体神经元放电完全消失，仅剩下中间神经元发放。这是由于锥体神经元是 AD 发病机制和认知功能障碍的核心[23]，神经纤维缠结的形成和淀粉样前体蛋白代谢失调和退化多发于锥体神经元，使得锥体神经元的电生理活性受到更严重的影响。
2.4 神经元网络关联性分析
基于 MEA 的神经元网络芯片还可挖掘各点信号之间的关系和特点，并能考察细胞与细胞信息之间的同步性和平行关系。3 组相近通道神经元发放的互相关分析如图8 所示，横轴为锋电位间隔时间，纵轴为锋电位数量，该图反应了两个通道神经元发放之间时间的关联性。如果互相关直方图平坦无规律，则两个放电序列视为各自独立的过程；如果互相关函数在 0 时刻出现峰值，则两个神经元有出现同步放电的趋势，两者存在共同输入或突触连接，其他形状则为相互促进或者抑制关系等。
图8
海马神经元网络通道间互相关性分析
Figure8.
Cross-correlation analysis of hippocampal neuronal network between different channels
由自然发放状态下各组通道之间自相关分析可知，通道 23 vs. 通道 44、通道 44 vs. 通道 76 记录到的神经元发放同步但不存在明显不应期，说明两个电极点可能记录到不同神经元的同步发放，而通道 73 vs. 通道 87 记录到的神经元发放同步且存在不应期，说明两个电极点记录到同一个神经元的发放。
AβOs 诱导 12 h 后，通道 23 vs. 通道 44、通道 44 vs. 通道 76 仍有同步发放，但相关性明显减弱，通道 73 vs. 通道 87 相关性消失。诱导 24 h 后，除了通道 44 vs. 通道 76 仍有微弱的同步发放，其余两组通道之间均无相关性。AβOs 诱导后导致突触可塑性降低乃至突触丢失，使突触的信息传输、加工，神经递质的储存、释放、再摄取，以及递质、受体、功能蛋白间相互作用的丧失，最终导致海马神经元网络之间的通信中断、信号与营养因子的传递受阻。
3 结语
本文提出了一种基于神经网络传感芯片的 AD 体外病理模型及其实时动态分析方法，在 MEA 芯片上培养海马神经元并形成网络，使用 AβOs 诱导 AD 体外模型，同时测量神经元网络的退行性生物电活动变化，实验结果显示该方法具有高通量、长时间、实时动态监测等优点。通过对锋电位信号的分析，提取出正负尖峰间隔、发放率、峰峰值等多个特征参数，并对锋电位进行了分类。记录了 AβOs 诱导后，中间神经元和锥体神经元在 24 h 内的发放模式，12 h 后发放幅值与频率逐渐减弱，24 h 后锥体神经元放电消失。AβOs 诱导可导致渐进性神经元网络功能障碍，通过空间多位点发放图谱和通道间的互相关性分析，评估神经元网络连通性的退化。本文实验结果证明该方法能够检测到 AβOs 的神经毒性作用，并分析验证了神经元网络通信功能的受损，今后或可成为一种高效实用的研究体外 AD 病理网络模型的新型技术。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
