서 론

박쥐류는 익수목(Chiroptera)에 속하는 포유류로, 전 세계에 1,300여 종이 알려져 있고[3], 나무가 자라지 못하는 추운 지역과 대양의 섬을 제외한 전 세계에 서식한다. 한국에서 서식하는 박쥐류는 관박쥐과(Rhinolophidae), 애기박쥐과(Vespertilionidae), 큰귀박쥐과(Molossidae)의 3과 10속 21종이 알려져 있다[25, 26]. 제주도는 용암동굴과 인공 진지동굴, 해안절벽, 한라산국립공원과 곶자왈 등의 삼림지대는 박쥐류가 서식할 수 있는 매우 좋은 환경을 제공하고 있다. 현재까지 제주도산 박쥐류에 대해서는 Mori [14]가 큰수염박쥐(윗수염박쥐, Myotis mystacinus)에 대한 보고를 시작으로 관박쥐 (Rhinolophus ferrumequinum), 큰귀박쥐(Tadarida teniotis)를 비롯하여 3과 7속 15종이 기록되어 있다[6, 7, 10, 16, 21, 26].

애기박쥐과(Vespertilionidae)에 속하는 Myotis 속의 박쥐들은 국내에 큰수염박쥐, 쇠큰수염박쥐(M. ikonnikovi), 우수리박쥐(M. petax), 붉은박쥐(M. formosus), 긴꼬리윗수염박쥐(M. frater), 큰발윗수염박쥐(M. macrodactylus), 흰배윗수염박쥐(아무르박쥐, M. bombinus), 대륙쇠큰수염박쥐(M. aurascens) 등 8종이 알려져 있다[6, 25, 26]. 최근 10년 동안의 조사결과를 정리한 보고에서 Myotis 속 3종(붉은박쥐, 큰발윗수염박쥐, 흰배윗수염박쥐)은 제주도에서 지속적으로 관찰되고 있으나, 이외 4종(큰수염박쥐, 쇠큰수염박쥐, M. brandtii, 우수리박쥐)의 문헌기록은 서식확인이 요구되고, 일부 종들은 분류학적 정리의 필요성을 제안하였다[17, 18].

Myotis 속 박쥐종들은 형태적 유사성과 서식지의 공유, 이종간 공동육아집단의 형성 등에 따라 종종 분류학적으로 어려움을 겪어왔고, 국내에서도 학자들 사이에 의견이 달라 동일종에 대한 국명이 여러 가지로 기재되기도 하였다. 이 중 큰수염박쥐는 우리나라와 동아시아에서 M. gracilis, M. brandtii 등과 형태적 차이에 따른 분류학적 재검토가 제기되었고[25], Myotis 속 동물들에 대한 분자유전학 연구결과에서도 유럽과 아시아의 종들에 대한 전반적인 분류학적 재검토의 필요성이 제기되었다[8, 19]. Tsytsulina et al. [24]은 그간 동일종으로 간주되었던 큰수염박쥐가 아시아와 유럽 집단이 형태적, 유전적 차이가 있어, 아시아 집단은 대륙쇠큰수염박쥐(M. aurascens)로 명명하는 것이 더 타당하고, 한반도 큰수염박쥐로 동정된 개체들 중 일부는 대륙쇠큰수염박쥐일 가능성이 있음을 제안하였다. 이후 대륙쇠큰수염박쥐가 전국적으로 발견되나, 제주도에는 분포하지 않는 것으로 기재하였으며[6], Oh [15]는 제주도에서 1개체를 확인한 바 있다.

본 연구는 아직까지 분포 현황과 집단의 계통 유연관계에 대한 연구자료가 전혀 없는 제주도 대륙쇠큰수염박쥐의 분포 현황을 확인하고, 수집한 개체들에 대한 형태적, 분자유전학적 종 동정과 타 집단과의 비교를 통하여 계통 유연관계를 살펴보기 위하여 이루어졌다.

재료 및 방법

관찰 및 포획 조사

대륙쇠큰수염박쥐의 제주도 내 분포 현황을 확인하기 위하여 2014년 9월부터 2015년 8월까지 제주도 서귀포시 상예동, 대정읍, 안덕면, 성산읍 지역과 제주시 아라동, 오등동, 연동, 한림읍, 한경면, 우도면, 조천읍, 구좌읍 등 25개 지역에 대한 현장조사를 수행하였다(Fig. 1). 현장조사는 동절기 및 활동기 방문 조사와 mist-net을 이용한 포획조사로 수행하였다. 대륙쇠큰수염박쥐가 발견된 장소는 최초 발견 후 월 2회씩 추가로 방문하여 서식여부를 재확인하였다. 발견된 장소별로 성체 1-2개체를 실험실로 옮겨 종 동정을 위한 형태측정을 수행하였고, 액침표본을 제작하였다. 실험은 제주대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호 2015-0020)을 받았으며 위원회의 동물실험 취급과 관리에 따른 규정에 준하여 수행하였다.

Fig. 1.Study site map. Circles indicate the survey sites of lava tubes (LT), sea caves (SC) and cave enforcements (CE): 1, Sameuiak CE; 2, Seosambong CE; 3, Gwangioreum CE; 4, Guemoreum CE; 5, Handeul-gul LT; 6, Igyeoreum CE; 7, Gamaoreum CE; 8, Saesinoreum CE; 9, Noknambong CE; 10, Gasiak CE; 11, Dansan CE; 12, Seotaloreum CE; 13, Songaksan shore CE; 14, Nonoreum CE; 15, Wollabong CE; 16, Gunsan CE; 17, Gaetgatdonggul SC; 18, Daramjui-gul SC; 19, Uitbeolari-gul LT; 20, Albeolari-gul LT; 21, Ilchulbong CE; 22, Udobong LT; 23, Udo-gul LT; 24, Utsanjeon-gul LT; 25, Bukoreum-gul LT. Black-colored circles indicate the observation and collection sites of M. aurascens in this study.

종 동정 및 외부 형태 측정

박쥐류 종 동정과 학명의 기재는 기존의 보고[5, 20, 25]를 따랐다. 외부형질 분석을 위해 체중(body weight, BM)과 모색, 특이사항을 기록한 후 다음 부위의 길이를 측정하였다: 머리-몸통(head body, HBL), 꼬리(tail length, TL), 전완(forearm, FAL), 귀(ear length, EL), 이주(tragus, Tra), 경골(tibia, Tib), 뒷발(hindfoot, Hfcu), 제 1지(digit 1, D1), 제 2지(digit 2, D2), 제 3지(digit 3, D3), 제 4지(digit 4, D4), 제 5지(digit 5, D5). 체중의 측정은 전자저울(MW11300, Cas, Korea)을 이용하여 0.1 g 단위까지 측정하였으며, 길이의 측정은 전자캘리퍼스(500-181-20, Mitutoyo, Japan)를 이용하여 0.01 mm 단위까지 측정하였다. 외부 형태 측정을 마친 시료들은 80% ethanol을 이용하여 액침표본을 제작하였다.

DNA 추출 및 PCR 증폭

현장에서 포획한 박쥐의 비막 punching 시료에서 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA는 PCR 반응을 위한 주형으로 이용하였다. 염기서열을 얻기 위해 NCBI database 상에 보고된 Myotis 속 박쥐류의 mtDNA 유전체 서열들(NC_022694, M. macrodactylus; NC_015828, M. formosus; NC_022698, M. ikonnikovi)을 기준으로 COI, CYTB 유전자 증폭용 프라이머들을 Primer3 web program을 이용하여 고안하였다: BatCOI_F, CAG GAT TGA AGC TGC TTC TTT GAA T; BatCOI_R, CCR ATW AYA TTA TAG CTC AYA CTA T; BatCYTB_F, GTG ACA CGA AAA ATC ACC GTT GT; BatCYTB_R, TTC CCC TTY TCT GGT TTA CAA GA. 유전자 증폭을 위한 PCR 방법은 Kerr et al. [9]의 방법에 준하여 수행하고, Maxime PCR Premix (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 반응한 후, Thermal Cycler 2720(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 1% agarose gel 상에서 전개하여 확인하였고, 증폭산물은 정제 후 DNA 서열 결정에 이용하였다.

염기서열 유사도 검색 및 계통 유연관계 분석

증폭된 PCR 산물은 QIAexII Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 정제하고, PCR primer를 이용하여 DYEnamic ET-Dye Terminator Kit (GE Healthcare, USA)로 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000(Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정은 BLAST 검색을 통해 NCBI database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 보고된 서열과 비교하였다. 연구를 통해 얻은 794-bp COI, 1,140-bp CYTB 유전자 서열들은 NCBI database 상에 등록하였다(CYTB, KT777800; COI, KT777801). 결정된 mtDNA COI, CYTB 서열들과 기존에 NCBI에 보고된 서열들을 수집한 후, CLUSTAL W program [12]으로 다중정렬하고, haplotype의 결정은 DnaSP v5 [13]를 이용하였다. 수집된 모든 서열들에 대한 계통 유연관계의 분석은 MEGA 6.0. program [22]을 이용하였다. 서열들 사이의 유전적 거리지수는 best model test를 통해 선정된 Tajima-Nei’s method [23]의 모델을 기준으로, 변이 지점에 대한 gamma 분포를 적용하였다. 계통수 작성은 대륙쇠큰수염박쥐에서 발견된 모든 haplotype 서열들과 근연종이면서 기존에 제주도에 서식하는 것으로 알려진 흰배윗수염박쥐(M. bombinus), 큰발윗수염박쥐, 붉은박쥐, 제주도 문헌기록종인 큰수염박쥐, M. brandtii, 우수리박쥐에서 보고된 서열들을 추가하였고(Table 1), 긴가락박쥐(Miniopterus schreibersii)의 서열을 outgroup rooting에 이용하였다. 산출된 거리지수에 대한 1,000회 bootstrap하여 neighbor-joining tree를 작성하였다.

Table 1.Accession numbers and localities of CYTB and COI sequences used in this study

결과 및 고찰

대륙쇠큰수염박쥐의 서식 확인 및 수집

현장조사 결과 대륙쇠큰수염박쥐는 2015년 5월과 6월에, 서귀포시 대정읍 송악산 해안진지동굴, 섯알오름 진지동굴, 제주시 한경면 가마오름 진지동굴 등 3개 지역에서 관찰되었다(Fig. 1). 관찰된 지역들은 모두 제주도 서부지역에 위치하고 있으며, 자연 용암동굴이 아닌, 인공 진지동굴이었다. 이 중 송악산 해안 진지동굴의 경우는 입구가 만조 시 해안선에 거의 맞닿는 장소로, 대륙쇠큰수염박쥐가 이용하는 서식처나 휴식처에 대한 보고에서 처음 기록된 장소이다. 대륙쇠큰수염박쥐가 발견된 3개 지역 중 섯알오름 진지동굴은 길이가 1 km가 넘는 대형 진지동굴이지만, 가마오름 진지동굴은 오름에서 발견되는 여러 개의 동굴 중 길이가 80 m 정도의 작은 동굴이었으며, 송악산 해안 진지동굴은 길이 60 m 정도의 동굴이었다. 따라서 이들의 경우 동굴의 길이와는 큰 상관없이 여름철 활동기의 휴식처로 소규모의 인공 진지동굴도 이용하고 있는 것으로 판단된다.

발견된 대륙쇠큰수염박쥐(Fig. 2)는 송악산 해안 진지동굴에서 5월말 30여 개체의 암컷 무리 중에서 채집되었고, 이들 중 18개체를 현장에서 성별을 확인하고, 이 중 8개체를 수집하였다. 섯알오름 진지동굴에서 발견된 대륙쇠큰수염박쥐는 2개체였으나, 긴가락박쥐, 관박쥐들과 비행 중인 상태에서 관찰되었고, 이 중 수컷 1개체를 포획하였다. 가마오름 진지동굴에서 관찰된 대륙쇠큰수염박쥐는 동굴 천정 돌 틈에서 휴식 중인 수컷 1개체를 수집하였다. 최초로 발견하여 수집한 시점부터 1-2주 간격으로 9월초까지 서식의 지속성 여부를 추적하였다. 최초 30개체 이상의 집단이 발견되었던 송악산 해안동굴뿐만 아니라 섯알오름, 가마오름의 진지동굴에서도 이후 대륙쇠큰수염박쥐는 재확인되지는 않았다. 또한 동절기 조사에서 동면중인 대륙쇠큰수염박쥐가 용암동굴이나 진지동굴에서 발견되지 않았다는 점에서 동면장소 확인을 위한 추가적인 조사가 필요하다고 하겠다.

Fig. 2.M. aurascens collected in the Songaksan cave enforcement.

제주도에서 대륙쇠큰수염박쥐의 기록은 Oh [15]가 1개체를 제주도 서부지역 셋알오름에서 발견하였다는 기록이 전부이다. 셋알오름은 본 연구의 조사지 중 하나인 섯알오름과 직접 연결되어 있으나 여러 개의 진지동굴이 구축되어 있어 이들이 서로 동일한 장소인지는 추가 확인이 필요하다. 1928년 Mori [14]에 의해 국내에서 큰수염박쥐를 발견하여 M. m. gracilis로 보고한 이후 큰수염박쥐는 한반도에서 지속적으로 발견되고 있는 것으로 알려져 있다. 하지만, 형태적 특성이 서로 다른 점에서 M. m. gracilis, M. m. mystacinus, M. brandtii 등이 개별 종으로 구분되어야 한다하였고[1, 4, 20], 이와 함께 우리나라 개체군에 대한 재검토도 제기되었다[25]. 또한, M. alcathoe, M. mystacinus, M. aurascens, M. brandtii 등은 특히 암컷과 어린 개체에서 동정이 매우 어렵고, 유전적으로도 구분할만한 marker가 충분하지 않다고 보고되었다[2]. 최근 Tsytsulina et al. [24]는 형태적인 특성 비교와 유전자 서열의 유사성을 근거로 대륙쇠큰수염박쥐가 큰수염박쥐와 구분되는 종이며, 한반도 표본 중 강원도에서 채집된 개체를 대륙쇠큰수염박쥐로 보고하였다. 산림성박쥐에 대한 연구보고에서 Han et al. [6]은 대륙쇠큰수염박쥐가 전국적으로 분포하지만, 제주도에는 분포하지 않는다고 기술하였다. 한반도 표본들과 마찬가지로 과거 제주도에서 채집, 관찰되었던 큰수염박쥐가 대륙쇠큰수염박쥐와 동일종일 가능성은 여전히 남아 있지만, 해당 표본들이 현재 확인되지 않고 있다. 문헌기록이 오동정이건, 기재상의 오류이건, 제주도 육상동물 중 박쥐류의 서식에 대한 체계적인 정리가 필요하다고 하겠다. 그럼에도 불구하고, Oh [15]의 보고와 본 연구를 통해 지속적으로 확인된다는 점에서 적어도 제주도 서부지역에서 대륙쇠큰수염박쥐가 서식하거나, 활동기 휴식처로 이용하고 있다는 것은 확실하다. 관찰된 개체들 중 일부의 표본을 확보하였다는 점은 향후 제주도와 한국 다른 지역의 박쥐류 연구에 있어 중요한 자료가 될 것이다.

제주도 대륙쇠큰수염박쥐의 형태 변이

제주도에서 수집한 대륙쇠큰수염박쥐의 외부 형태를 측정한 결과는 Table 2에 제시한 바와 같다. 암컷 8개체와 수컷 2개체에서 측정한 자료에서는 암컷이 수컷에 비해 FAL, D2, D4의 길이가 더 긴 것으로 나타났으나, 개체 수가 적어 통계적인 유의성은 검출되지 않았다. 반면 Oh [15]의 기록에 제시된 우리나라 전체에서 수집된 7개체의 자료와 비교했을 때, HBL과 Hfcu는 한반도 집단이 1.47 mm, 0.39 mm 정도 더 길었고, TL, EL, FAL은 제주도 집단이 4.07 mm, 1.00 mm, 0.89 mm 정도 더 길었다. 또한 Tra는 제주도 집단(8.28±0.42 mm)이 한반도 집단(7.83±0.81 mm)에 비해 0.47 mm 정도 더 길게 나타났다. 유럽의 박쥐류에서 보고[2]와 비교했을 때, 제주도 집단은 FAL의 범위가 34.7-38.2 mm 정도로 유럽 집단(32.0-37.4 mm)보다 더 길었다. 한편, Hfcu는 제주도 집단(6.42-7.68 mm)이 유럽 집단(6.8-8.7 mm)에 비해 더 넓은 크기 변이를 나타내었고, Tib는 제주도 집단(16.22-18.04 mm)보다 유럽 집단의 변이 폭(15.7-18.1 mm)이 더 넓게 나타났다.

Table 2.*, abbreviations of each trait are given in the Materials and Methods section. **, one of those was collected in the Jeju Island by Oh (2013).

제주도 대륙쇠큰수염박쥐의 유전적 집단 구조와 계통 유연관계

NCBI database 상에 보고되어 있는 서열들과의 유사도 검색을 위한 BLAST search 결과 제주도에서 수집한 10개의 대륙쇠큰수염박쥐 CYTB 서열들은 우리나라 강원도에서 보고된 서열인 AY665148 [24]와 유사도 97.91%로 가장 유사하였고, 두 지역 개체 사이에서 20개의 염기치환이 발견되었다(자료 미기재). 제주도 대륙쇠큰수염박쥐 10개의 COI 서열 역시 모두 동일하였고, Mongolia에서 보고된 COI 서열인 JX008048 [11]과 유사도 98.78%로 가장 유사하게 나타났다. 유사도 검색에 따른 결과는 제주도에서 수집된 대륙쇠큰수염박쥐 시료들이 유전적으로 기존에 보고된 M. aurascens 서열들과 가장 유사하고, 유사도 97% 이상으로 동일종이라 판단되었다.

Fig. 3은 CYTB, COI 유전자 서열의 다형성에 근거한 NJ tree를 나타낸 것이다. 제주도와 강원도의 대륙큰쇠수염박쥐 서열들은 계통수 상에서 M. aurascens의 범주 내에 위치하여, 이들은 기존에 유럽(Western Russia, Moldavia)과 아시아(Kazakhstan, Kyrgyzstan, Turkmenistan, Iran, Central Russia)에서 보고된 M. aurascens와 동일종으로 판단하였다. COI 서열을 이용한 계통수에서도 제주도 집단은 모두 동일한 서열을 보유하고 있었고, 중국, Mongolia, Kazakhstan, Ukraine 등에서 보고된 M. aurascens의 COI 서열들과 같은 분지에 출현하였다.

Fig. 3.Neighbor-joining trees based on the sequence polymorphisms of CYTB (left) and COI (right) of M. aurascens collected in Jeju Island and its related species. The CYTB and COI sequences of the Jeju Island population are found on the branches of both phylogenetic trees with those of M. aurascens previously reported in NCBI database. The number near the nodes is bootstrap value.

이상의 결과를 정리해 보면, 제주도 내 서남부권인 서귀포시 대정읍 송악산 해안 진지동굴과 섯알오름 진지동굴, 제주시 한경면의 가마오름 진지동굴에서 채집된 암컷 8개체와 수컷 2개체는 모두 동일한 모계선조에서 유래된 것으로 추정되었다. 또한 CYTB 서열 계통수에서 강원도 영월군의 대륙쇠큰수염박쥐와 동일한 분지를 형성한다는 점에서 유럽이나 아시아의 타 지역 집단보다는 한반도 집단과 근연이며, 한반도를 통해 제주도로 이주한 집단일 가능성이 더 높다고 판단된다. 하지만, 계통 사이의 유연관계를 보다 명확하게 설명하기 위해서는 한반도와 중국 등 인근 아시아 집단의 정보를 확보하여 종합적인 분석을 수행하여야 할 것이다.

결 론

본 연구를 통해 대륙쇠큰수염박쥐의 암컷과 수컷들이 집단수준으로 제주도 서남부 지역의 해안 진지동굴과 오름 진지동굴에 서식하고 있음을 확인하였다. 이들이 큰수염박쥐로 기재되었던 과거의 문헌기록과 동일종인지 여부는 확인할 수 없으나, 제주도에 지속적으로 서식하고 있음은 확실하다. 최초 발견 지역에 대한 재확인 과정에서 추가로 확인되지 않았다는 점에서 진지동굴을 활동기 때 일시적으로 이용하는 것으로 추정되며, 동면 장소와 휴식처에 대한 지속적인 현장조사가 요구된다고 하겠다. 형태적으로 한반도에서 채집된 개체들에 비해서 HBL과 Hfcu는 다소 작고, TL, EL, FAL, Tra 등은 더 길었고, 또한 유럽 집단과도 변이의 폭에서 차이를 나타내어, 시료 확보와 함께 지역별 집단 사이의 비교연구가 수반되어야 할 것이다. 유전자 분석에 이용한 모든 개체들이 동일한 mtDNA 서열을 갖는다는 점에서 3개 지역에서 발견된 10개체들이 모두 하나의 모계선조 집단에서 유래되었을 가능성이 있음을 추정할 수 있다. 유전자 서열의 유사도가 한반도나 Mongolia의 개체들에서 보고된 것들과 가장 유사한 것으로 드러나 동아시아계열에 해당하는 집단으로 판단되나, 2% 이상의 염기치환율을 나타낸다는 점에서 유전자 서열을 이용한 계통 유연관계 분석이 요구된다고 하겠다. 결론적으로, 본 연구를 통해 대륙쇠큰수염박쥐의 제주도 서식을 확인하였으나, 한반도 집단, 유럽 집단과 형태적으로도 차이를 나타내며, 유전적으로도 한반도 집단과 다소 다른 양상을 나타냄으로써, 향후 다양한 분야의 연구가 진행되어야 할 것이다. 이러한 연구결과는 향후 제주도 포유동물 연구를 수행하는 데 중요한 자료가 될 것으로 판단된다.