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La hipertensión arterial pulmonar neonatal (HAPN) es una condición fisiopatológica definida como un aumento de la presión arterial pulmonar media sobre 25 mmHg, asociada a algún grado de hipoxemia como resultado de una inadecuada vasodilatación pulmonar al nacimiento1,2. Esta condición clínica tiene una prevalencia de hasta 7/1.000 nacidos vivos en tierras bajas, representando un grave problema clínico con alta morbimortalidad3. Sin embargo, su prevalencia es desconocida en alturas geográficas superiores a 2.500 metros sobre el nivel del mar (msnm), aunque se ha sugerido que podría alcanzar hasta 10% en recién nacidos vivos4.
La patogénesis de la HAPN se caracteriza por una disfunción endotelial, estrés oxidativo aumentado, aumento de parámetros inflamatorios y remodelamiento vascular patológico determinado por una hiperplasia e hipertrofia de la capa media, engrosamiento de la adventicia e íntima y un aumento de la matriz extracelular, provocando una vasorreactividad anormal tendiente a un tono vasoconstrictor5–7.
Entre los factores involucrados en la vasorreactividad pulmonar, destacan la vía dependiente de óxido nítrico (NO) y la vía prostanoide, las cuales tienen su acción en la musculatura lisa vascular pulmonar5,6,8. Los prostanoides se generan a partir de ácido araquidónico presente en membranas celulares, el cual es metabolizado por las enzimas ciclooxigenasa-1 (COX-1, isoforma constitutiva) o ciclooxigenasa-2 (COX-2, isoforma inducible), que sintetizan prostaglandina PGH28,9. A partir de PGH2 y la acción de sintasas específicas, se generan las prostaglandinas PGD2, PGE2, PGF2α, prostaciclina (PG12) y tromboxano (TX), cada una asociada a un receptor de membrana específico DP1, Ep1-4, FP2, Ip y Tp, respectivamente9,10.
Los agentes prostanoides se pueden clasificar de acuerdo con su acción vasoactiva. En el primer grupo se encuentran las prostaglandinas vasodilatadoras PGD2 y PGI2, catalizadas por la prostaglandina D2 sintasa (PGD2S) y PGI2 sintasa (PGI2S), respectivamente. Los prostanoides vasoconstrictores son PGF2 producto de la prostaglandina F sintasa (PG-F), TX formado por tromboxano sintasa (TXs) y PGE2 generado por la prostaglandina E sintasa (PGE2S). Los prostanoides vasodilatadores activan a la proteína Gs, actuando sobre la enzima adenilato ciclasa, generando AMPc, molécula que activa la proteína quinasa A (PKA), lo que finalmente disminuye la biodisponibilidad de Ca2+ intracelular asociado a una vasodilatación arterial. Por otro lado, los prostanoides vasoconstrictores pueden activar dos tipos diferentes de proteína G. Los receptores Tp, Ep1 y FP2 activan a la proteína Gq que permite la formación de IP3, movilizando Ca2+ desde el retículo sarcoplasmático al citosol, generando una activación de la maquinaria contráctil celular. En contraste, el receptor Ep3 activa la proteína Gi, que aumenta los niveles de Ca2+ intracelulares al inhibir la acción de la adenilato ciclasa9,10.
Se ha descrito un rol importante de las especies reactivas de oxígeno (ERO) en el aumento de la reactividad vasoconstrictora pulmonar asociado a HTP11,12. Asimismo, las ERO pueden unirse directamente al NO disminuyendo su biodisponibilidad5,13. Finalmente, las ERO afectarán la relajación normal de la arteria pulmonar en respuesta a vasodilatadores y favorecen el remodelamiento patológico13.
Actualmente existe solo un tratamiento aprobado por la Food & Drug Administration de Estados Unidos de Norteamérica para la HAPN, que consiste en la administración de NO inhalado, que induce una rápida y selectiva vasodilatación pulmonar1,14. Sin embargo, ensayos clínicos revelan que cerca de 40% de los pacientes no responden o responden parcialmente a esta terapia1,2, por ello, nuevos tratamientos son necesarios para combatir esta condición. Por esta razón, en nuestra búsqueda de nuevos tratamientos para HAPN, hemos postulado a melatonina, que tiene propiedades vasodilatadoras, antioxidantes y antiremodelante en la circulación pulmonar neonatal15,16. Estudios muestran diversos efectos de melatonina a nivel vascular, como mejorar la capacidad vasodilatadora y función endotelial pulmonar15, ser agente antirremodelante previniendo la excesiva proliferación de la túnica media16,17 y antioxidante, pudiendo neutralizar directamente a las ERO (scavenger)18. Además, se ha demostrado que melatonina induce la expresión del transcrito y/o proteínas de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa y la catalasa15, y también modula negativamente los mecanismos prooxidantes como la eNOS desacoplada y las lipooxigenasas18. Asimismo, se han descrito escasos efectos adversos exclusivamente durante la gestación19,20. Sin embargo, aún se desconocen las vías vasodilatadoras pulmonares que son favorecidos por melatonina.
En este estudio se evaluó el efecto de la administración neonatal de melatonina sobre las vías prostanoides pulmonares. Específicamente, se analizaron los efectos de melatonina en el nivel de transcrito y de proteína de sintasas y receptores de la vía prostanoide vasoconstrictora y vasodilatadora en tejido pulmonar de neonatos de ovejas con HAPN gestados, nacidos y criados en hipoxia crónica.
Material y Método
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Bioética sobre Investigación en Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile (CBA#0761), además de seguir las indicaciones de las guías internacionales de cuidado y uso de animales en investigación y el reporte de sus resultados21.
Muestras biológicas
Para este estudio se utilizaron 10 corderos (Ovis aries) recién nacidos con hipertensión pulmonar, modelo caracterizado en estudios previos7,15,16,22,23. Las ovejas madres de estos corderos concibieron y gestaron en hipoxia hipobárica en el Centro Internacional de Estudios Andinos de la Universidad de Chile (INCAS, Putre a 3.600 msnm). Al nacer, los corderos fueron estudiados y mantenidos con sus madres en el mismo centro de investigación. Los grupos experimentales se dividieron en: grupo control (C), tratados con vehículo (0,5 mL*kg−1 de etanol al 1,4%, n = 5) y grupo tratado (M) con melatonina (Sigma-Aldrich código M5259, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania; 1 mg*kg−1 de melatonina en 1,4 % etanol, n = 5). Los tratamientos fueron administrados diariamente, vía oral, a las 20 h, desde el día 4 al 21 postnatal. Para evaluar que los cambios fisiológicos atribuidos a melatonina perduraran en el tiempo, los corderos se mantuvieron por 7 días sin tratamiento (desde el día 22 al 28 postnatal). Finalmente, los animales fueron eutanasiados (tiopental sódico, Opet, Laboratorios PRO-VET, Santiago, Chile; 100 mg*kg−1, vía endovenosa) a los 28 días de edad y se obtuvieron muestras de parénquima pulmonar, que fueron congeladas y mantenidas en nitrógeno líquido (-197°C) hasta su utilización.
Expresión de mRNA de sintasas y receptores de la vía prostanoide
La purificación de RNA en tejido pulmonar, síntesis de ADN complementario (cDNA) y la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se efectuó como se ha descrito previamente15. Para esto, se diseñaron partidores para la amplificación de los genes de ciclooxigenasas, agentes prostanoides vasoconstrictores y vasodilatadores (Tabla 1).
Tabla 1 Partidores para la amplificación de los genes
| partidor | Secuencia 5’-3’ | Tm (°C) | Ciclos | Tamaño del amplicon (pb) |
|---|---|---|---|---|
| COX 1 | ||||
| F | CTCATCGGGGAGACCATCAA | 62,5 | 35 | 276 |
| R | AGAAAAGGCGTCCACCAGG | |||
| COX 2 | ||||
| F | CAGAATGGGGCGATGAGC | 62 | 35 | 204 |
| R | GATGCCAGTGGTAGAGCGTG | |||
| TXS | ||||
| F | CGGATTTTGCCCAATAAGA | 59 | 33 | 192 |
| R | AAAGACCTGACGGACGATG | |||
| TP2 | ||||
| F | GCGAGGTGGAGATGATGGT | 62 | 33 | 257 |
| R | GCTCAGGCGAGGGTAGAAG | |||
| PGI2S | ||||
| F | GGCTGGAGAGTTACCTGCTG | 60 | 35 | 217 |
| R | ATCTGTGAAATGGGCTGCTC | |||
| IP | ||||
| F | GGTTGACCACCTGATTCTGC | 60 | 33 | 192 |
| R | ACGGACTTTCGGAAGAGGAT | |||
| 18s | ||||
| F | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 58 | 20 | 152 |
| R | CCATCCAATCGGTAGTAGCG |
Abreviaturas: COX-1: ciclooxigenasa 1; COX-2 : ciclooxigenasa 2; TXS: tromboxano sintasa; TP2: receptor de tromboxano; PGI : rostaciclina sintasa; Ip: receptor de prostaciclina; F: partidor forward; R: partidor reverse.
Los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa 2% en buffer de tris, acetato y ácido etilendiaminotetraacético (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA), y luego se visualizaron con luz ultravioleta y fotografiaron digitalmente. Finalmente, la imágenes se cuantificaron mediante densitometría con un programa computacional (Scion Image Beta 4.02 Win; Scion Corporation, MD, USA).
Expresión de proteína de sintasas y receptores de la vía prostanoides
La extracción de proteína a partir de pulmón se realizó mediante homogenización mecánica en buffer RIPA como se describe en trabajos de Torres F et al y Astorga CA et al15,16. Los lisados de proteína (1-40 μg según proteína) fueron separados por electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE (4% de gel concentrador y 10% de gel de corrida al 10%). La electroforesis se realizó en una cámara (Mini-PROTEAN Tetra Cell/ Blotting System, Bio-Rad, CA, USA), a un amperaje constante de 50 mA por 2 h aproximadamente. Posteriormente las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa a 50 mV por 2 h. Finalmente, la expresión proteica de COX-1, COX-2, TXs, Tp, PGIs, Ip y β-actina se realizó por immunoblot utilizando anticuerpos específicos: anti-COX-1, 160108; anti-COX-2, 160116; anti-Txs, 160715; anti-Tp, 101882; anti PGIs, 160640 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA); anti-Ip (Sc-365268, Santa Cruz Biotechnology Inc.) y anti β-actina (AC-15, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La inmunodetección se realizó a través de anticuerpos secundarios conjugados con horseradish-peroxidase (HRP) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-conejo o ratón, según corresponda. Posteriormente, la membrana fue montada en una cámara reveladora C-Digit Modelo 3600 (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA), y se cuantificó la expresión proteica por densitometría clásica utilizando el programa Image Studio 3.1 Imagening Software (LI-COR Biosciences. Lincoln, NE, USA). Las densidades de las señales fueron expresadas como razón de β-actina para normalizar por carga.
Análisis de datos
Los resultados se expresaron como promedio ± error estándar de la media. Se determinó la distribución de la muestra mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. La comparación entre grupos se realizó por prueba de Mann Whitney (prueba no paramétrica del t test) y las diferencias se consideraron significativas cuando p ≤ 0,05 (Prism 5.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)15,16.
Resultados
Expresión de mRNA y proteína de ciclooxigenasas
La expresión de transcrito (mRNA) para COX-1 fue similar entre grupos (Figura 1A, C). En contraste, melatonina indujo una disminución significativa en la expresión de mRNA de COX-2 en comparación con el grupo control (Figura 1B, C). Con respecto a la expresión de proteínas de las ciclooxigenasas, no hubo cambios en los niveles de COX-1 entre los grupos analizados (Figura 1D, F). Sin embargo, el tratamiento con melatonina logró disminuir la expresión proteica de COX-2 (Figura 1E, F) en comparación con el grupo control.
Figura 1 Niveles de transcrito y proteína de ciclooxigenasas. Los resultados se expresan como promedio ± E.S.M. de mRNA para COX-1 (A) y COX-2 (B) y proteína para COX-1 (D) y COX-2 (E). Se muestran imágenes representativas de los ensayos de RT-PCR (C) y Western blot (F). Los grupos son control (C, n = 6, barras blancas) y tratados con melatonina (M, n = 5, barras negras). Diferencias significativas (p ≤ 0,05) = *vs C.
Expresión de mRNA y proteína de la vía vasoconstrictora prostanoide
Los niveles de expresión de la sintasa de tromboxano (TXs) a nivel de transcrito (Figura 2A, C) y de proteína (Figura 2D, F) no mostraron diferencias significativas entre los grupos analizados. A la vez, tampoco se observaron diferencias entre grupos en la expresión proteica (Figura 2E, F) o nivel de transcrito (Figura 2B, C) del receptor de tromboxano (Tp).
Figura 2 Niveles de expresión de la sintasa y receptor de tromboxano. Los resultados se expresan como promedio ± E.S.M. de mRNA para TXs (A), Tp (B) y proteína de TXs (D) y Tp (E). Se muestran imágenes representativas de los ensayos de RT-PCR (C) y Western blot (F). Los grupos son control (C, n = 6, barras blancas) y tratados con melatonina (M, n = 5, barras negras). Diferencias significativas (p ≤ 0,05) = *vs C.
Expresión de mRNA y proteína de la vía vasodilatadora prostanoide
El tratamiento con melatonina indujo un aumento significativo en la expresión de transcrito de la prostaciclina sintasa (PGI2s) en comparación al grupo control (Figura 3A, C), aunque a nivel de su receptor Ip no se observaron diferencias significativas a nivel de transcrito (Figura 3B, C). En contraste, no se observaron cambios en la expresión proteica de la sintasa de prostaglandina PGI2 (Figura 3D, F), mientras que el tratamiento con melatonina aumentó de manera significativa la expresión proteica del receptor Ip (Figura 3E, F) en comparación con el grupo control.
Figura 3 Niveles de expresión de la sintasa y receptor de prostaciclina. Los resultados se expresan como promedio ± E.S.M. de mRNA para PGIs (A), Ip (B) y proteína de PGIs (D) y Ip (E). Se muestran imágenes representativas de los ensayos de RT-PCR (C) y Western blot (F). Los grupos son control (C, n= 6, barras blancas) y tratados con melatonina (M, n = 5, barras negras). Diferencias significativas (p ≤ 0,05) = *vs C.
Discusión
Los resultados de este estudio demuestran que un tratamiento con melatonina durante las primeras tres semanas de vida con una dosificación farmacológica diaria de 1 mg*Kg−1 logró modular de manera diferencial la expresión de las vías prostanoides en pulmón de corderos. En primer lugar, melatonina logró disminuir a nivel de transcrito y de proteína la COX-2 sin cambios en la expresión de COX-1. Se ha demostrado que la expresión de COX-2 (forma inducible de las ciclooxigenasas) aumenta en diferentes condiciones fisiopatológicas, como estrés oxidativo, cuadros inflamatorios y proliferación celular asociada a crecimiento tumoral en diferentes tejidos8,24,25. Por lo tanto, una disminución de la COX-2 podría ser indicador de menor estrés oxidativo e inflamación pulmonar. Con respecto a lo anterior, se ha demostrado que melatonina disminuye el estrés oxidativo y la presión pulmonar en neonatos15,16 y adultos26 de modelos animales. Los efectos antioxidantes de melatonina están asociados a sus características de: 1) scavenger de radicales libres, 2) inducción de la maquinaria enzimática antioxidante y 3) disminución de la expresión de enzimas prooxidantes27, lo cual disminuye el tono oxidativo en el territorio pulmonar15,17,18. Además, melatonina puede modular la producción de diferentes mediadores inflamatorios como TNF-α vía receptor, disminuyendo de esta forma el tono inflamatorio a nivel celular y la sobreexpresión de COX-228–30. Por otro lado, se ha visto que la ausencia de COX-2 trae como consecuencia una exacerbación de la hipertensión pulmonar y del remodelamiento patológico31, sin embargo, estos estudios solo modifican la expresión genética de COX-2, sin modificar otros parámetros involucrados en la vasorreactividad.
Se ha demostrado que la administración de melatonina normaliza la sobreexpresión de COX-2, TNF-α e iNOS disminuyendo, además, los niveles de NF-kB en células cultivadas y modelos animales30. En este sentido es relevante destacar que la acción de melatonina tiende a normalizar los parámetros inflamatorios y permitir una expresión a un nivel similar al fisiológico de COX-2.
En términos del balance vasoactivo que presenta el lecho pulmonar, el cuadro clínico de la HAPN se caracteriza por presentar un marcado aumento de los vasoconstrictores a nivel pulmonar13,14. Si bien este trabajo no mostró diferencias en la expresión a nivel de mensajero ni de proteína de la vía dependiente de tromboxano (TXs-Tp), sí mostró un aumento del transcrito en la expresión de sintasa PGI2, la cual favorece un balance prostanoide vasodilatador24,25. Interesantemente, además, melatonina indujo un aumento de la expresión del receptor Ip, favoreciendo la acción vasodilatadora de PGI2.
La hipertensión pulmonar posee un componente inflamatorio25, y en base a esto, se ha demostrado que melatonina es capaz de inhibir las traslocación y acción transcripcional del NFk-B29,32 que, a su vez, activa el factor TNF-a, suprimiendo la expresión del transcrito de PGIs32. Asimismo, la acción antioxidante y antiinflamatoria de melatonina estaría inhibiendo la traslocación al núcleo de NFk-B, impidiendo la activación de TNF-α, lo que conduciría a un aumento en los niveles de transcrito de PGIs. A nivel proteico, melatonina logró inducir la expresión del receptor Ip sin cambiar la sintasa de prostaciclina PGIs, lo que sugiere un aumento en la sensibilidad de la respuesta vasodilatadora de PGI2. La actividad de PGIs y el efecto de PGI2 debiese ser foco de estudio en futuras investigaciones para confirmar esta sugerencia.
La HPTN se asocia a una alteración de la respuesta vascular pulmonar, comandada principalmente por el endotelio y las células musculares lisas. Si bien este trabajo solo estudió el efecto de melatonina en la vasorreactividad mediada por prostanoides, esta vía junto a la oxidonitrérgica son las principales responsables de mantener el tono a nivel vascular. Estudios previos han demostrado que una administración aguda de melatonina logra aumentar ex vivo la vasodilatación dependiente de óxido nítrico, además de inducir una respuesta vasodilatadora mediada por alguna vía independiente de óxido nítrico en arterias de resistencia pulmonar15.
Existe un amplio rango de dosis de melatonina (0,0005 - 100 mg totales) descrito en la literatura, en los cuales no se han visto efectos adversos. En este sentido, este trabajo continúa la exploración de mecanismos vasoactivos realizada por trabajos anteriores15,16, los que mostraron efectos del tratamiento mejorando el estrés oxidativo y la función vascular.
Se concluye que el tratamiento postnatal con melatonina oral induce efectivamente la expresión de agentes prostanoides vasodilatadores, lo que ayudaría a contrarrestar la disfunción endotelial caracterizada por un predominio del tono vasoconstrictor propio del cuadro clínico de la HAPN.
De este estudio se infiere que el uso de melatonina tiene potenciales usos terapéuticos en la HAPN. Los efectos a nivel pulmonar persisten en el tiempo, a pesar del término de la administración del tratamiento. Por ello, consideramos que melatonina podría ser una potencial terapia coadyuvante para el tratamiento de esta patología.
