Address for correspondence : Kyu Yup Lee, MD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, School of Medicine, Kyungpook National University, 50 Samdeok-dong 2-ga, Jung-gu, Daegu 700-721, Korea
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서     론

   난청은 사람에게서 가장 흔한 감각계 질병이다.¹⁾ 감각신경성 난청의 원인은 유전, 이독성, 자가면역, 감염, 노화 등 다양하며 난청의 원인과 치료를 위해 사람을 대상으로 한 연구에는 한계가 있다. 그러므로 대체동물을 이용한 많은 기초 연구들과 중계연구들이 진행되고 있다. 이 중 설치류를 이용한 동물연구가 활발히 이루어지고 있으나 기초적인 정보가 부족한 점이 있다. 여기에서는 설치류에서 와우 연구를 위한 몇 가지 기본적인 조직학적, 형태학적 검사 방법들을 소개하고자 한다.

고정(Fixation)

   조직학적 연구는 생물체를 구성하고 있는 여러 조직을 연구대상으로 하는 방법이다. 기본적인 순서는 먼저 조직의 고정(fixation)이라 할 수 있다. 세포 구조를 보존하기 위해 화학적으로 조직의 고정과정을 거쳐 세포나 조직을 있는 그대로 보존하고 모든 효소과정이나 대사과정을 중지시켜 고정 후 변화(postfixation change)를 최소화한다. 조직의 고정과정은 신뢰성 있는 조직학적 실험과정의 가장 중요한 부분 중의 하나로 실험의 성공과 실패를 결정짓는 중요한 과정이다. 불완전한 고정(underfixation)은 조직의 형태적 보존이 이루어지지 않고 해당 조직의 검출이 불가능해 질 수 있고 과고정(overfixation)은 고정오류(fixation artifact), 특정 조직 신호의 소실, 또는 비특이적 배경신호의 노이즈(noise) 등을 유발할 수 있다.²⁾ 이상적인 고정은 조직이나 세포의 구조, 형태나 위치를 있는 그대로 유지하고 특정 분자물질들의 손실을 방지할 수 있는 방법이어야 하며 조직의 항원성(antigenicity)을 있는 그대로 유지하고 항원의 변성을 최소화하며 조직내 물질의 확산이나 재배열을 방지하는 것이다.²⁾ 
   지금까지 고정액의 개발은 역사적으로 가죽의 처리(leather tanning)과정에서 경험적으로 이루어졌다. 많은 고정액들은 각각의 장단점을 가지고 있어 실험의 목적에 따라 주의해서 사용해야 한다. 각 고정액들은 고정된 조직에서 특이분자물질의 소실, 조직처리과정 중 조직의 팽창이나 수축, 조직학적 혹은 면역조직학적 염색의 정도 차이(variation of quality), 생화학적 반응 과정의 정확성, 소세포 구조의 보존 정도 등의 차이를 보인다.³⁾ 적절히 처리된 조직은 미세 세포간의 관계나 세포질이나 핵과 같은 세포 내 구조, 세포 외 구조물과 세포 내 화학적 조성을 유지한다. 조직내의 단백질, 펩타이드, RNA, DNA, 지질 등의 소실을 최소화하여야 세포막, 소포체(endoplasmic reticulum), 핵막, 라이소좀, 미토콘드리아 등의 파괴를 막을 수 있다. 세포 내 가용성부분(soluble component)을 보존해야 염색시 미토콘드리아 등의 미세 구조를 유지할 수 있으며 면역조직학적 염색시 조직의 구조나 조직의 항원성을 유지할 수 있다.³⁾ 조직은 세포내외 물질의 파괴를 최소화하기 위해 적절한 시간에 조직을 고정액에 처리해야 한다. 현재 많이 이용되고 있는 고정액으로는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 포름알데히드(formaldehyde), 메탄올이나 아세톤(methanol/acetone)들이다. 알데히드(aldehyde)계는 광학현미경이나 전자현미경을 이용한 검사전에 조직고정에 가장 널리 사용되는 고정액이다. 이 중 글루타르알데히드는 오탄소디알데히드[five carbon dialdehyde, CH2(CH2CHO)2]로 세포의 미세구조를 가장 잘 보존시키는 고정액으로 전자현미경법에 적합(fixative of choice)하며 미세소관(microtubule) 등의 면역형광법 고정에 사용된다.²⁾ 그러나 일반적인 면역형광법에서는 조직 항원성을 변화시켜 적절한 항체반응을 억제하므로 주의해서 사용해야 한다. 글루타르알데히드는 조직단백의 아미노산부분과 Schiff 염기를 형성하여 중합체를 형성하고 이것이 조직과 단단한 교차결합(crosslink)을 형성한다.²⁾ 
   조직학적 검사를 위해서는 다소 큰 조직에 적합한 다중중합체로 이루어진 "Technical grade"보다는 EM급의 글루타르알데히드를 사용해야 하며 특히 전자현미경을 위해서는 필수적이다. 글루타르알데히드는 단백질과의 반응이 빠르지만 큰 분자물질에는 조직 침투성이 느리다. 글루타르알데히드의 알데히드그룹(free aldehyde group)은 항체나 Schiff's reagent와 같은 단백질성 물질과 강한 비특이적 결합을 형성하기 때문에 면역조직염색, 렉틴조직염색(lectin histochemistry), PAS 염색시에는 적절치 않으며, 만약 사용시 알데히드그룹을 제거하거나 조직과 교차결합을 차단한 후 다음 과정을 진행하여야 한다.³⁾ 글루타르알데히드에 의해 고정된 조직은 단단한 결합에 의해 파라핀과 같은 고분자 물질의 침투를 방해하고 조직절편을 어렵게 하여 많은 오류(artifact)를 초래한다. 그러나 플라스틱모노머(plastic monomer)의 경우에는 글루타르알데히드 고정조직에도 효과적으로 침투하여 초박막절편(ultrathin section)을 가능케 한다. 이와 같이 면역조직학을 위한 조직고정으로 글루타르알데히드는 적절치 못하지만 글루타르알데히드 고정조직에서도 사용 가능한 항체를 개발해서 glutamate, GABA 같은 신경전달물질의 조직학적 연구에 사용, 보고하였다.³⁾ 
   어떤 면역형광법에서는 0.01~0.5% 글루타르알데히드가 사용될 수 있다. 2% 글루타르알데히드는 상온에서 한 시간 동안 700 µm의 조직두께를 침투할 수 있다.²⁾ 경우에 따라서는 글루타르알데히드는 비특이적 형광을 유발하기도 한다. 자발형광(autofluorescence)은 고정 후 인상완충용액(PBS) mL 당 1.0~1.5 mg의 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)을 녹인 용액에 5분씩 두 차례의 세척으로 일부 방지할 수 있다.⁴⁾ 포름알데히드는 일탄소알데히드(one-carbon monoaldehyde)로 파라포름알데히드로부터 만들어지며 대부분의 단백질의 위치추적(localization)을 위한 일반적인 고정액으로 많이 이용된다. 포름알데히드는 기체상태의 물질로, 물에서 메틸렌하이드레이트(methylene hydrate)의 형태로 존재하며 37~40%의 포름알데히드를 포함한 수용액이 널리 알려진 포르말린(formalin)이다.³⁾ 이것은 소수분자중합체(low polymer)이며 이것이 모여 형성한 다중분자중합체(n이 100 이상)는 불용성이며 하얀 분말의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)이다.³⁾ 그러므로 고정액으로 사용되기 위해서는 단위체(monomeric) 포름알데히드가 되어야 한다. 파라포름알데히드는 물에서는 잘 녹지 않아 용액화하는데 며칠이 걸리지만 생리적인 ph의 버퍼용액에서는 녹게 된다. 파라포름알데히드는 섭씨 60도의 열을 가할 경우 쉽게 녹일 수 있다. 주로 상용으로 만들어진 4% 포름알데하이드는 중합체 생성에 의해 침전을 방지하기 위해 1%의 메탄올을 포함하고 있다. 여기에는 포름산이 적은 양이나마 포함되어 있어서 장기간 보관된 포름알데히드용액은 메탄올과 포름산의 농도가 증가하게 된다. 그러므로 상용의 포름알데히드용액은 메탄올을 포함하고 있기 때문에 실험조직의 고정에 사용되어서는 안 된다. 그래서 초미세구조를 관찰할 수 있는 전자현미경을 위한 EM급 포름알데히드에는 메탄올이 포함되어 있지 않다. 
   포름알데히드의 조직 고정효과는 조직에서 단백질과의 반응에 의해 이루어지며 대개 24시간 내에 완전히 이루어진다. 포름알데히드로 고정된 조직 내 단백질과 연결된 탄수화물이나 지질 핵산 등은 수 주 이상 장기간 고정하는 경우를 제외하고는 특별히 조직구조가 변형되지는 않는다.²⁾ 포름알데히드는 조직에 빠르게 침투하지만 단백질과의 반응은 서서히 진행된다. 특히 삼투압이나 탈수에 저항하는 조직인 경우에 적절한 고정은 며칠이 걸린다. 관류(perfusion) 등에 의한 짧은 고정은 조직의 자가용해(autolysis)를 막고 조직을 경화시키며 비등장성의 삼투액에 의한 조직의 손상을 방지한다. 이 과정은 동결절편(frozen section)에서 조직의 건전성(structural integrity)을 향상시키며 특히 15~30% 수크로스(sucrose) 등의 동해방지제(cryoprotectant)를 고정 이후에 사용할 때 효과가 좋다.²⁾ 단지 몇 시간의 포름알데히드 고정 후 조직이 탈수화 될 때는 고정되지 않은 세포질 내 단백질의 변성을 가져오므로 주의해야 한다. 포름알데히드는 글루타르알데히드와는 달리 항원결정부(epitope)의 인식을 저해하지 않으므로 대부분의 면역형광법에서 가장 좋은 고정액이다. 포름알데히드는 조직단백질과 메틸렌다리(methylene bridge)를 형성하며 글루타르알데히드가 조직과 형성하는 교차결합보다는 다소 약한 결합을 보인다.²⁾ 이유는 포름알데히드는 아주 작은 분자로 조직 내 교차결합을 형성하는 부분과 교차결합을 형성하지 않는 부분이 존재하고 교차결합을 형성하더라도 다소 가역성(reversible)을 띄어 고정 후 세척과정 등으로 탈고정(unfixed) 될 수 있다. 다소 약한 고정액이므로 조직학적 그리고 면역세포화학적 연구에 널리 이용되고 있으며 특히 핵산(nucleic acid)의 고정에 효과적이다. 4% 파라포름알데히드는 상온에서 한시간 동안 2 mm의 조직두께를 침투할 수 있다.²⁾ 또 포름알데히드를 사용시 조직의 자발형광현상은 두드러지지 않는다. 포름알데히드는 조직의 고정작용은 약하지만 조직에 빨리 침투할 수 있고 글루타르알데히드는 강한 고정작용은 있으나 조직 침투성은 다소 떨어지기 때문에 경우에 따라서는 글루타르알데히드와 포름알데히드를 혼합하여 사용하기도 한다. 예를 들면 전자현미경을 위해서는 빠른 조직침투와 강한 고정물질과의 강한 상호결합의 효과를 얻을 수 있는 포름알데히드와 글루타르알데히드를 섞어서 사용할 수 있다. 두 용액의 혼합고정액 중 하나로 알려진 Karnofsky 고정액은 4% 글루타르알데히드를 포함하고 있으나 현재에는 half-strength Karnovsky 고정액이 많이 사용되고 있다.⁵⁾ 메탄올과 아세톤(acetone) 용액은 알데히드보다는 빠른 고정효과를 가지며 세포골격(cytoskeleton)과 같은 부분의 연구에 사용된다. 단백질과 탄수화물의 석출(precipitation)에 의한 고정반응이기 때문에 항원의 위치변동을 초래할 수 있고 고정과 투과(permeabilization)를 동시에 진행하기 때문에 가용성의 항원은 처리과정 중 소실될 수도 있으며 고정과 탈수과정이 동시에 진행되므로 조직의 수축을 유발한다.²⁾

투과과정(Permeabilization)

   알데히드 고정 후 세포 내 요소를 염색하기 위해서는 계면활성제(detergent)나 유기용매(organic solvent)를 이용하여 세포막이나 핵막(nuclear enveleop)의 지질층을 녹여 투과과정(permeabilization)이 필요하다. 세포외 기질(extracellular matrix)이나 세포표면 항원의 위치추적을 위해서 투과과정은 불필요하다. 흔히 사용되는 투과용액으로는 세포막의 인지질을 녹이는 효과를 가진 0.1~0.5% 농도의 Triton X-100, NP-40, Brij-58 등이다. 앞선 투과용액과는 달리 세포막의 콜레스테롤을 녹이는 효과를 가진 사포닌(saponin)은 세포막의 손상이 덜한 고정액으로 투과 후 과정에서 사포닌이 존재하지 않을 때 세포막의 비투과성이 재생되기 때문에 세척이나 항체처리과정에서 사포닌이 포함되어야 한다.²⁾ 그러므로 막구조가 중요한 실험에서 사용되며 상온에서 0.5%의 농도로 사용된다. 디기토닌(digitonin)은 세로막의 콜레스테롤과 β-hydroxysterol이 결합함으로써 세포막에 선택적으로 투과효과를 나타내며 형광물질의 핵이동실험(nuclear transport assay)에 사용되고 있다. 메탄올과 아세톤도 투과효과를 가지고 있으내며 고정과 투과를 동시에 진행할 수 있는 장점이 있다. 액틴함유섬유(actin containing stress fiver)나 중간섬유(intermediate filament)와 같은 세포골격 연구과정에 이용된다. 그러나 앞서 언급했던 것처럼 다소 불안정한 항원성을 가진 세포조직연구에는 적합하지 않다. 기본적인 효과와 달리 특정조직에서 가장 효과적인 고정방법과 투과방법은 경험적으로 결정되며 적절한 실험프로토콜(protocol)을 찾아 적용해야 한다.

조직박편(Sectioning Tissue)

   광학현미경 수준의 형태학적 연구에 사용되는 조직박편방법으로는 동결절편(cryosection; frozen section), 파라핀절편(paraffin section), 플라스틱절편(plastic section; methacrylate) 방법이 있다. 동결절편은 조직처리과정이 짧아 실험시간을 절약할 수 있으며 상대적으로 간편하게 면역조직화학법, 유전학적 연구, 생화학적 연구에 이용할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 파라핀절편에 비해 양질의 절편(quality of section)이 어렵고 지질조직이나 골화조직은 절편이 어려운 단점을 가지고 있다. 파라핀보다 더 단단한 플라스틱절편은 1 µm 이하의 미세절편도 가능하고 매우 단단한 조직도 절편이 가능한 장점을 가진다. 파라핀절편과 플라스틱절편은 복잡한 고정과 처리과정이 필요하지만 동결절편과 비교해서 월등한 양질의 형태학적 검사가 가능하다. 과거에 면역조직화학법과 유전학적 검사에서의 우월성을 보였던 동결절편은 파라핀절편에서도 가능한 방법이 개발됨으로써 차차 그 장점이 퇴색하고 있다. 그러나 파라핀절편은 경험 있는 연구자로부터의 교육과 경험이 필요한 방법이다.²⁾ 동결절편은 일반적으로 조직항원성의 보존에 우월성을 가져 면역조직화학법에 많이 이용되고 있으며 조직은 이소펜탄(isopentane)이나 액화질소에 빠른 동결이 필요하며 작은 조직이나 세포는 OCT compound에서 동결할 수 있다. 이때 얼음결정형성을 감소시키고 조직의 형태적 변화를 줄이기 위해 빠른 동결이 중요하다. 수용성의 메타크릴산메틸(methyl methacrylate)은 박막(semithin)절편이 가능하여 광학현미경법에서 해상도를 향상시킬 수 있다. 이것은 상온에서 조직 내 수분(water)의 제거 없이 연부조직이나 경부조직(hard tissue)에 상관없이 침투 중합할 수 있어 양질의 조직 보존과 형태학적 유지가 가능하다. 플라스틱 내포매질(plastic embedding medium)은 조직의 변형(distortion)이나 수축(shrinkage)이 다른 내포매질방법에 비해 적은 방법이고 처리과정 중 조직이 독한 유기용매나 고온에 노출되지 않기 때문에 미세한 생물학적 구조와 조직화학적 반응을 보존하는 장점이 있으나 처리과정에 다소 많은 특별한 기계가 필요하고 높은 비용이 소요되며 메타크릴산메틸의 독성으로 취급에 주의해야 하는 단점을 가진다.²⁾ 기본적인 플라스틱절편의 방법은 조직을 4% 포름알데히드의 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 4℃에서 하루 정도 고정 후 생후 7일 이상의 마우스의 경우에는 0.25 M ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)로 3일 정도 탈회법(decalcification)을 시행한다. 30%에서 100%까지 에탄올로 각각 최소 20분간의 순차적 탈수화 과정 후 Immunobed Kit를 이용하여 플라스틱을 침투(infiltration), 내포(embedding) 후 마운팅 후 5 µm 두께의 절편을 만들고 1% toluidine blue를 이용하여 염색하고 에탄올과 크실렌으로 세척 후에 광학현미경을 이용하여 관찰한다(Fig. 1).⁶⁾

헤마톡실린-에오신 염색[Hematoxylin-Eosin(H&E)]

   세기(century) 전에 개발되었지만 여전히 다양한 조직에서 형태학적 연구를 위해 가장 기본적으로 실시할 수 있는 염색법으로 세포질, 핵, 세포외기질 등 광범위한 부분의 형태학적 연구에 이용되고 있다. 이외에도 기본 염색법으로 공기 중 건조에 의한 고정법을 이용하는 Giemsa 염색과 두꺼운 조직에서 투과성의 염색을 보이는 Papanicolaou 염색이 있다. 헤마톡실린은 기전은 완전히 밝혀져 있지 않지만 핵산을 청자색(blue-purple color)으로 염색시키며 에오신은 단백질을 비특이적으로 분홍색으로 염색시킨다. 그러므로 일반적인 조직에서 핵은 청자색으로 세포질은 분홍색으로 염색된다. 핵소체는 에오신으로 염색된다. 만약 세포내 폴리리보솜(polyribosome)이 많을 경우에는 세포질은 청색캐스트(blue cast)를 보이며 골지체는 세포핵 주위에 염색이 되지 않은 부분으로 나타나는데 이는 면역형광법에 적절하지 않은 것이 단점이다. 그러나 헤마톡실린만을 사용한 염색은 면역조직화학법이나 alkaline phosphatase나 peroxidase 같은 물질을 사용한 혼성화(hybridization) 과정에서 대조염색(counterstain)으로 사용할 수 있다. 기본적인 방법은 준비된 조직슬라이드를 증류수에 30초간 담구어 고정액, 이물질들을 제거한 후 Mayer 헤마톡실린 염색액에 30초간 담근 후 증류수에 1분간 세척한다. 염색농도를 확인 후 염색이 충분하지 않을 경우 헤마톡실린 염색과 증류수 세척을 반복한다. 이후 에오신으로 10~30초 정도 염색 후 95% 알코올에 30초씩 두 차례, 100% 알코올에 30초간 두 차례 탈수시킨 후 크실렌(xylene)으로 알코올을 제거하고 마운팅(mounting) 한다(Fig. 2).²⁾ 

세포의 자가형광성(Autofluorescence)

   조직의 자가형광성은 형광물질을 이용한 조직학적 연구에 큰 문제를 야기한다. 그러므로 표지자가 없는 대조군(unlabeled control slide)을 이용하여 자가형광성의 정도를 확인하여야 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다. 포유류 조직에서의 자가형광성은 flavin coenzyme(Flavin adenine dinucleotide, FAD와 Flavin monocucleotide, FMN: 흡수파장, 450 nm; 발광파장, 515 nm)와 pyridine nucleotide(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH: 흡수파장, 340 nm; 방출파장, 460 nm)에 의해 발생한다.²⁰⁾ 그러므로 자가형광성이 문제가 된다면 문제의 파장을 감소시킬 수 있는 필터나 해당 파장의 신호를 피할 수 있는 표지자를 사용하여야 한다. 고정된 세포를 0.1% 수소화붕소나트륨(NaBH4)에 20분 정도 처리하면 어느 정도 조직의 자가형광성을 감소시킬 수 있다.⁴⁾

세포의 비면역적 형광 표지(Nonimmunological Fluorescent Labeling of Cellular Structures)

   사용되는 전형적인 형광물질은 로다민(rhodamine), 플루오레세인(fluorescein), BODIPY, NBD, 카르보시아닌(carbocyanine) 등이다. 다양한 세포조직을 표지할 수 있는 비면역적 형광표지자들이 개발되어 소개되고 있는데 예를 들면 세포막을 염색할 수 있는 Dil-C16(3)이나 NBD-PE, TMA-DPH 등이 있다. 액틴(F-actin)을 염색하는 것으로 rhodamine phalloidin(rhodamine isothiocyanate-phalloidin, RITC-phalloidin)이나 fluorescein phalloidin(FITC-phallidin) 등이 있다[RITC(1：1,000), Mouse; Fig. 3].²⁾ phalloidin 염색은 메탄올로 고정된 조직에서는 효과적인 염색이 되지 않으나 2% 글루타르알데히드로 고정된 조직은 염색 가능하다. 핵을 염색하는 것으로는 DAPI(Fig. 4), Hoechst33342 등이 있다. 

면역조직화학법(Immunohistochemistry)

   1940년대 Albert H. Coons가 처음 형광색을 항체와 결합시켜 면역 조직학적 염색을 시도한 이후 조직학적 연구방법에 획기적인 발전이 이루어졌다.⁷⁾ 
   면역형광법에는 형광물질이 표지된 일차항체가 조직의 항원과 결합하는 직접면역형광법과 형광물질이 표지된 이차항체가 조직의 항원과 반응한 일차항체에 결합하는 간접면역형광법이 있다. 직접면역형광법은 형광물질이 표지된 일차항체의 수가 제한적이고 이런 형태의 항체를 만드는 비용과 시간이 많이 소요되고 과정이 복잡하여 많이 사용되지 않으며 현재 대부분 간접면역형광법이 이용되고 있다. 
   면역형광법에 의한 위치측정(localization)은 특정 생물학적 분자물질(항원)에 특이적 항체를 사용하여 가시화 될 수 있고 형광의 강도에 따른 표지 정도의 정량화도 가능하다.²⁾ 면역형광법은 항체의 특이도, 조직처리과정, 조직의 자가형광, 현미경의 숙달정도에 따라 정도의 차이가 발생한다. 항체의 특이도는 면역반응에 사용된 항원의 순수정도에 따라 달라지며 친화 정제에 의한 다중클론성 항체(affinity purified polyclonal antibody)나 단클론성 항체는 특이도가 높은 항체이다.²⁾ 간접면역형광법의 근간이 되는 항체 즉 면역글로블린(immunoglobulin)에는 5가지가 있지만 면역조직학적 연구에는 이중 면역글로불린의 약 75%를 차치하는 IgG가 주로 이용된다.⁸⁾ 
   다중클론성 항체(polyclonal antibody)는 포유류에서 면역반응에 의해 생산된다. 항원을 동물에 주사하면 B 림프구에서 IgG가 생산되며 이것을 정제하면 혈청(serum)당 1~10 mg/mL 농도의 IgG를 얻을 수 있다.⁸⁾ 이 과정에서 얻은 항체는 다양한 면역 세포에 의해 생산되므로 다중클론성 항체라고 불린다. 항체생산에 이용되는 동물로는 염소, 말, 토끼, 기니픽, 햄스터, 마우스, 래트(rat), 양, 닭 등으로 이 중 토끼와 마우스가 널리 사용된다. 염소 등의 큰 동물은 대량의 항체를 생산할 때 이용되며 닭은 알의 난황낭(yolk sac)으로 많은 양의 항체(Ig Y; Ig G)를 전달(transfer)하여 출혈과정 없이 항체를 생산할 수 있어 선호되기도 한다.⁸⁾ 
   단클론성 항체는 하나의 세포주(cell line)에서 생산된다.⁸⁾ 항체를 생산하는 세포와 융합된 종양세포(tumor cell)-이 두 세포를 통칭해서 hybridoma라 일컫는다-에서 무한히 복제가 가능하다. 이는 한 모세포에서 복제된 세포이기 때문에 단클론성 항체라 불린다. 주로 항원을 주입 후 면역반응에 의해 유도된 마우스 비장(spleen)에서 분리된 면역세포와 융합된 암세포(주로 myeloma 세포)에 의해 항체가 무한히 생산된다. 그러므로 항체를 생산하는 암세포를 세포배양에 의해서 생산할 수도 있고 마우스의 복강 내에 hybridoma 세포가 항체를 포함한 복수를 유발시켜 항체를 생산할 수도 있다.⁸⁾ 
   현재는 윤리적인 문제 등으로 동물을 이용한 항체생산보다는 세포배양을 이용한 항체생산이 선호된다. 단클론성 항체의 생산에 마우스뿐만 아니라 토끼도 이용되고 있으며 이 경우 더 높은 항체 특이성을 보여준다고 한다. 이처럼 생산된 다클론성 항체나 단클론성 항체는 형광이 융합된 이차항체(secondary antibody)를 사용해서 형광현미경을 통해 관찰된다. 예를 들면 Molecular Probes 사에서는 Alexa Fluor 형광에 접합(conjugation)된 단백질 A 또는 G(protein A 또는 Protein G)를 이차항체로 제공한다. 이런 단백질 A(S. aureus의 세포막구성물질) 또는 단백질 G(Group G streptococcus 세포막 구성물질)는 면역글로불린의 Fc 위치와 특이적으로 결합하는 성질을 가지고 있고 이런 성질을 이용한 것이 간접 두 단계(indirect two step) 면역조직학적 방법의 이차 항 Ig G 항체(secondary anti-Ig G antibody)의 원리다.⁸⁾ 만약 금분말과 접합된 단백질 A 또는 단백질 G는 전자현미경을 위한 면역조직학적 방법에 이용될 수 있다면 항원항체반응에 의한 면역조직학적 방법을 위해서 항체는 효소(enzyme), 형광물질(fluoropore), 골드콜로이드(Colloidal Gold), 또는 비오틴(biotin) 등과 표지(labeling)되어야 한다. 광학현미경에서 관찰 가능한 효소적 방법은 발색반응(chromogenic reaction)에 의한 효소조직학적 방법(enzyme immunohistochemical method)이다. 형광표지(fluoropore label)는 형광현미경에 의해 직접 관찰이 가능하며 골드(gold)를 이용하면 전자현미경에서 관찰가능하며, 비오틴표지는 ABC 기법을 통해 광학, 형광, 전자현미경에서 관찰이 가능하다. 비오틴과 비슷한 물질로 digoxigenin나 dinitrophenol 등이 있다. 
   기본 과정은 준비된 동결 절편된 조직슬라이드를 PBS로 세척한 후 0.5% Triton-X 100에 10분간 투과과정(permeabilization)을 거쳐 10분씩 3차례의 PBS 세척을 실시한다. 10% NGS(normal goat serum)를 녹인 PBS에 상온에서 10~30분간 블로킹(blocking)을 실시하여 비특이적 단백질 반응을 방지한다. 만약 일차항원이 염소로부터 제작되었다면 10% Bovine serum albumin(BSA)을 사용하여 블로킹을 할 수 있다. 이후 조직슬라이드를 일차항원에 4℃에서 6시간 이상 반응시킨 후 PBS로 10분간 3차례 세척하고 이차항체를 상온에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 10분간 3차례 세척하고 증류수로 염(salt)을 간단히 세척 후 조직슬라이드를 건조시킨 후 마운팅한다. 세척과정은 PBS 대신 0.1% Tween-20를 사용할 수 있다(Fig. 5).^2,9,10)

투과전자현미경(Transmission Electron Microscope)

   일반램프(파장 약 500 nm)를 광원으로 사용하는 광학현미경과 달리 투과전자현미경은 전자[electron; 파장 약 6 pm(10-12 m)]를 광원으로 사용하여 나노미터 크기의 물체를 관찰할 수 있다. 500 nm의 파장을 가진 일반광원으로는 최대 200 nm의 해상도를 가질 수 있으나 더 높은 해상도를 위한 보다 짧은 파장의 광원(400 nm보다 짧은 파장의 광선은 자외선영역이다)은 일반 광학현미경으로 관찰이 불가능하다.²⁾ 투과전자현미경의 원리는 전자발생기로부터 방출된 전자빔이 조직을 투과하고 조직의 밀도에 따라 흡수되거나 산란되고 통과한 전자빔의 일부가 전파렌즈(electromagnetic lens)에 의해 초점이 맞추어져 바닥의 스크린에 도달하여 영상이 만들어진다. 즉 조직의 밀도에 따른 전자빔의 그림자에 의해 이미지가 만들어지게 된다.¹¹⁾ 100,000 V 전압의 전자 파장은 0.0038 nm로 이 전자빔을 이용시 예측해상도는 0.24 nm에 달한다.²⁾ 전자현미경법을 위한 조직처리과정에서는 몇 가지 중요한 점을 염두에 두어야 한다. 첫째, 월등한 해상도로 조직의 고정이 적절해야 한다. 광학현미경법을 위한 메탄올이나 포르말린은 조직의 변형을 초래하여 초미세구조를 관찰하는 전자현미경법을 위한 고정액으로는 적합하지 않다. 둘째, 영상은 진공상태에서 얻어지기 때문에 조직의 탈수화가 필수적이다. 셋째, 조직이 전자가 투과할 수 있을 정도로 얇아야 한다. 즉 250 nm 이상의 조직 두께는 통상적인 투과전자현미경에서 영상을 얻을 수 없다. 그러므로 조직은 플라스틱레진(plastic resin)에 포매(embedding)되어야 초박막 절편이 가능해진다. 넷째, 일반조직은 전자현미경에서 영상을 얻을만큼의 대비(contrast)가 부족하므로 대개 납과 같은 중금속으로 염색이 되어야 한다.²⁾ 
   간단히 조직처리 과정을 살펴보면 동물을 마취시킨 후 2% 글루타르알데히드와 2.5% 포름알데히드의 PBS 용액으로 심장 내 관류시킨 후 측두골을 채취하고 2% 글루타르알데히드와 2.5% 포름알데히드의 0.15 M sodium cacodylate buffer(SCB)로 4℃에서 1~4시간 정도 고정 후 만약 마우스가 생후5일령 이상인 경우 0.2 M EDTA가 포함된 고정액으로 1주일간 탈석회화 시킨다. 0.1 M SCB 용액으로 4℃에서 20분간 3차례 세척한 후 1% OsO₄가 함유된 SCB 용액에 4℃에서 30분 정도 고정과정을 실시한다. 4℃에서 증류수로 5분간 3차례 세척한 후 1% 수용성 uranyl acetate(UA)와 50% 에탄올로 10분에서 하루 동안 염색한 후 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% 에탄올로 4℃에서 각각 2분간 순차적으로 탈수화 과정을 거친 후 Epon과 Aralidite의 혼합 레진(resin)을 조직에 침투시킨 후 (1 : 1 에탄올 : 레진 용액에 하루 동안 조직에 침투시킨 후 100% 레진으로 3시간 동안 2차례의 침투과정) 60℃에서 하루정도 포매과정과 중합과정을 거친 후 경화된 조직을 다이아몬드 칼로 70 nm 두께의 초박막절편을 얻은 후 추가적 납(lead) 염색 후 투과전자현미경으로 관찰한다(Fig. 6).^2,12) 

주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy)

   내이는 복잡한 구조를 가진 기관으로 다양한 세포로 구성되어 있다. 특히 소리를 와우신경으로 전달하기 위한 Corti organ은 미세하고 독특한 구조로 이루어져 있으므로 광학현미경을 통한 관찰로는 그 해상도에 한계가 있어 미세구조 수만 배를 확대하여 나노미터 단위의 형태를 관찰 할 수 있는 전자현미경을 이용한 관찰이 필수적이다. 주자전자현미경은 세포의 미세한 표면구조를 관찰 할 수 있는 현미경으로 고정과 현미경내의 진공상태에서 관찰이 가능하게 조직의 건조, 백금이나 금을 이용한 표면처리의 과정이 필요하다. 원리를 간단히 설명하면 전자현미경에서 나온 전자(electron)가 조직과 충돌하면 조직의 표면에서 이차적인 전자가 방출되고 이것을 현미경(detector)에서 검출하여 나오는 전자의 수에 따라 명암이 결정됨으로써 최종 이미지가 완성된다.¹³⁾ 여기에서는 내이 중에서 유모세포의 전자현미경적 관찰에 대한 부분을 기술하고자 한다. 
   Osmium-thiocarbohydrazide-osmium-thiocarbohydrazide-osmium(OTOTO)법을 기본으로 하여 조직을 처리한다.^14,15) 내이 조직을 2.5% glutaraldehyde와 2 mM CaCl₂가 포함된 0.1 M sodium cacodylate 용액에 37℃에서 한 시간에서 두 시간 정도 고정한 후 조직을 2 mM CaCl₂가 포함된 0.1 M sodium cacodylate buffer로 옮겨 4℃에서 한 시간 동안 세척한다. 내이 와우와 전정 감각상피를 분리(dissection) 후 증류수로 씻고 포화된 thiocarbohydrazide에서 20분간 처리 후 증류수로 다시 씻고 1% OsO4에 한 시간 처리 후 0.1 M sodium cacodylate로 씻고 thiocarbohydrazide와 OsO₄를 순서대로 두 번 더 처리 후 에탄올로 탈수시킨다. 액화이산화탄소로 임계점건조(critical point dry)를 한 후 은이나 금으로 표면을 코팅한 후 주사전자현미경으로 사진을 촬영하여 영상을 얻는다. 이 과정에서 주의할 점은 신선한 EM-grade 글루타르알데히드를 사용하여야 고정에 따른 오류(fixation artifact)를 막을 수 있다. 글루타르알데히드는 세포막의 투과성에는 영향을 미치지 않기 때문에 고정과정에서 세포삼투압의 유지가 중요하다. 만약 고정과정 중 세포삼투압이 유지가 되지 않을 때는 세포막의 미세구조에 변형이 올 수 있다.¹³⁾ 글루타르알데히드의 농도도 중요하며 대상 조직에 따라 결정된다. 고정과정은 상온에서 실시되는 것이 효과적인 고정과정이 이루어진다. 고정이 끝난 조직은 글루타르알데히드를 깨끗이 씻는 것이 좋다. OsO₄용액이 주사전자현미경을 위해 필수적인 것은 아니지만 탈수화 과정에서 세포막 지질의 손상을 방지해 세포막을 유지시키는 효과가 있다.¹⁵⁾ OsO₄는 기화성이 있는 독성 물질로 배출후드(fume hood) 하에서 사용해야 하며 플라스틱과는 반응성이 있어 유리병을 이용해야 한다. 에탄올을 이용한 탈수화 과정에서 90% 에탄올에서는 하루(overnight) 정도 놔둘 수 있으며 100% 에탄올로 탈수 후 임계점건조를 실시한다.¹³⁾ 이후 주사전자현미경을 통해 이미지를 얻는다(Fig. 7).

페인트 충전법(Paint Fill Analysis)

   마우스의 형태학적 검사방법 중 일반적인 절편이나 조직학적 검사방법으로는 와우의 복잡한 입체적인 형태를 연구하고 관찰하는 데 한계가 있다. 여러 가지 3차원적 형태 연구를 위해 컴퓨터단층촬영, 자기공명영상 등을 이용한 영상의 재구성을 통해 간접적으로 와우의 입체구조를 재현하고 있으나 특별한 장치기계와 시간, 비용이 많이 소요되는 점 등의 한계를 가진다. 1993년도에 소개된 페인트 충전법은 백색 페인트를 내이의 막미로(membranous labyrinth)에 주입하여 막미로의 형태를 입체적으로 관찰할 수 있는 방법이다.¹⁶⁾ 이 방법을 이용한 내이의 발달과정에 대한 많은 연구가 있어 왔고 특히 돌연변이 유전자를 가진 마우스의 막미로 이상이 효과적으로 보고되었다.^17,18,19,20) 과정은 먼저 보디안 고정액(Bodian fixative: 5% gracial acetic acid, x% formaldehyde, 70% ethanol)에 측두골부분을 채취하여 하루 동안 처리한 후 100% 에탄올로 두 차례 세척한다. 에탄올로 18시간 정도의 탈수화 과정 후 methyl salycilate로 조직을 투명화시킨다. 충분히 투명화된 조직에 백색의 페인트를 막미로 내에 주입하여 영상을 얻는다(Fig. 8). 

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