Authors:	Garg, Archit
Title:	Biophysical and structural characterization of the interaction of the circadian transcription factor BMAL1 with its coactivator CBP
Online publication date:	13-May-2020
Year of first publication:	2020
Language:	english
Abstract:	The mammalian CLOCK:BMAL1 transcription factor complex and its coactivators CREB-binding protein (CBP)/p300 and mixed-lineage leukemia 1 (MLL1) play a central role in circadian transcriptional regulation and chromatin modification. The interactions of BMAL1’s C-terminal transactivation domain (TAD) with the KIX domain of CBP/p300 (activating) and with CRY1 (repressing) as well as the BMAL1 G-region preceding the TAD regulate the circadian oscillations. The repressive BMAL1-TAD-CRY1 interactions are enhanced by the circadian acetylation of Lys-537 within the BMAL1 G-region. The CBP-KIX domain interacts with a plethora of transcription regulators via its two distinct pockets referred to as MLL- and CREB-pKID/c-Myb-binding pockets, typically targeting the intrinsically disordered regions within the TAD, which often attain folding upon binding to the KIX domain. In this thesis, we characterized the interaction of the CBP-KIX domain with BMAL1 proteins including the BMAL1-TAD, parts of the G-region, and Lys-537. Tethering the small compound 1-10 in the MLL-binding pocket of the CBP-KIX domain weakened BMAL1 binding and MLL1-bound KIX did not form a ternary complex with BMAL1, indicating that the MLL-binding pocket is important for KIX-BMAL1 interactions. Additionally, mutations in the second pKID/c-Myb-binding pocket of the KIX domain moderately impacted BMAL1 binding. The BMAL1(K537Q) mutation mimicking Lys-537 acetylation, however, did not affect the KIX-binding affinity, in contrast to its enhancing effect on CRY1 binding. Moreover, KIX binding does not induce the formation of extended regular secondary structures in BMAL1. SAXS models of BMAL1 and BMAL1:KIX complexes revealed that the N-terminal BMAL1 G-region including Lys-537 forms elongated extensions emerging from the bulkier BMAL1-TAD:KIX core complex. Fitting high-resolution KIX domain structures into the SAXS-derived envelopes suggested that the G-region emerges near the MLL-binding pocket, further supporting a role of this pocket in BMAL1 binding. This study significantly advances the mechanistic understanding of the roles of the BMAL1-TAD-CBP-KIX interaction and its interplay with other KIX ligands and with the BMAL1-CRY1 interaction in circadian gene regulation. Der Säuger-Transkriptionsfaktorkomplex CLOCK:BMAL1 und seine Coaktivatoren CREB-Bindungsprotein (CBP)/p300 und Mixed-Lineage-Leukämie 1 (MLL1) spielen eine zentrale Rolle bei der zirkadianen Transkriptionsregulation und Chromatinmodifikation. Die Wechselwirkungen der C-terminalen Transaktivierungsdomäne (TAD) von BMAL1 mit der KIX-Domäne von CBP/p300 (aktivierend) und mit CRY1 (reprimierend) sowie die BMAL1-G-Region vor der TAD regulieren die zirkadianen Oszillationen. Die repressiven BMAL1-TAD-CRY1-Wechselwirkungen werden durch die zirkadiane Acetylierung von Lys-537 in der BMAL1-G-Region verstärkt. Die CBP-KIX-Domäne interagiert mit einer Vielzahl von Transkriptionsregulatoren über zwei Bindestellen, den sogenannten MLL- und CREB-pKID/c-Myb-Bindetaschen, die typischerweise auf die intrinsisch ungeordneten Regionen innerhalb der TAD abzielen, die häufig beim Binden an die KIX-Domäne eine Faltung erreichen. In dieser Arbeit haben wir die Wechselwirkung der CBP-KIX-Domäne mit BMAL1-Proteinen einschließlich BMAL1-TAD, Teilen der G-Region und Lys-537 charakterisiert. Das Binden der kleinen Verbindung 1-10 in der MLL-Bindetasche der CBP-KIX-Domäne schwächt die BMAL1-Bindung und MLL1-gebundenes KIX bildet keinen ternären Komplex mit BMAL1, was darauf hinweist, dass die MLL-Bindetasche für KIX-BMAL1-Wechselwirkungen wichtig ist. Darüber hinaus wirkten sich Mutationen in der zweiten pKID/c-Myb-Bindetasche der KIX-Domäne mäßig auf die BMAL1-Bindung aus. Die BMAL1 (K537Q) -Mutation, die die Lys-537-Acetylierung nachahmt, beeinflusste jedoch nicht die KIX-Bindungsaffinität, im Gegensatz zu ihrer verstärkenden Wirkung auf die CRY1-Bindung. Darüber hinaus induziert die KIX-Bindung nicht die Bildung ausgedehnter regulärer Sekundärstrukturen in BMAL1. SAXS-Modelle von BMAL1 und BMAL1:KIX-Komplexen zeigten, dass die N-terminale BMAL1-G-Region einschließlich Lys-537 Verlängerungen bildet, die aus dem sperrigeren BMAL1-TAD:KIX-Kernkomplex hervorgehen. Das Einfügen von hochauflösenden KIX-Domänenstrukturen in die von SAXS abgeleiteten Hüllen deutete darauf hin, dass die G-Region in der Nähe der MLL-Bindestasche auftritt, was eine weitere Rolle dieser Tasche bei der BMAL1-Bindung unterstützt. Diese Studie verbessert das mechanistische Verständnis der Rolle der BMAL1-TAD-CBP-KIX-Wechselwirkung XVII und ihres Zusammenspiels mit anderen KIX-Liganden sowie mit der BMAL1-CRY1-Wechselwirkung bei der zirkadianen Genregulation erheblich.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1640
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000035061
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XVII, 151 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen