Online high throughput microfluidic single cell analysis for feed-back experimentation

Sachs, Christian Carsten; Wiechert, Wolfgang; Usadel, Björn

doi:37743

Online high throughput microfluidic single cell analysis for feed-back experimentation = Online-fähige mikrofluidische Hochdurchsatz-Einzelzellanalyse mit rückgekoppelter Experimentsteuerung

Sachs, Christian Carsten^RWTH*

2018 & 2019

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Christian Carsten Sachs

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (xiv, 241 Seiten) : Illustrationen

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2019

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)^RWTH* ; Usadel, Björn (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-06-06

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-231907
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/752157/files/752157.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Corynebacterium glutamicum (frei) ; Streptomyces lividans (frei) ; feed-back experimentation (frei) ; image analysis (frei) ; microfluidic cultivation (frei) ; single-cell analysis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Zelluläre Heterogenitäten spielen beim Verständnis und dem Optimieren bio(techno)logischer Prozesse eine wichtige Rolle. Die mikrofluidische Einzelzell-Kultivierung in Verbindung mit Lebendzell-Zeitraffermikroskopie bietet ein mächtiges Werkzeug um die Heterogenitäten auf Einzelzellniveau zeitlich aufgelöst zu untersuchen. In diesem Gebiet wurden in den letzten Jahren vielseitige Kultivierungssysteme sowie Bildverarbeitungswerkzeuge beschrieben. Hierbei werden Bilddatensätze nach dem Experiment analysiert, was zu einem statischen Ablauf mit nachgeschaltetem Erkenntnisgewinn führt. Bilddaten direkt bei ihrer Entstehung zu analysieren, ermöglicht das schnellere Erlangen von Erkenntnissen und eröffnet neue Experimentiermöglichkeiten, bei der die Ergebnisse rückgekoppelt zur weiteren Steuerung der Abläufe verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden online-fähige Verfahren zur rückgekoppelten Experimentsteuerung erarbeitet: Die Anwendung und Entwicklung von Bildanalysepipelines, sowie die Entwicklung der neuen Plattform HiMiCs, zur automatischen Experimentführung: Für die die Analyse von 1D-Wachstumskanälen wurde eine bestehende Bildanalysepipeline angewandt und angebunden, zur Auswertung filamentös wachsender Mikroorganismen in Kultivierungskammern eine neue Bildanalysepipeline entwickelt und angewandt, und ein Verfahren zur Segmentierung stäbchenförmiger Bakterien wurde auf Basis von maschinellem Lernen entwickelt. Die Experimentplattform HiMiCs bietet Möglichkeiten zur Steuerung des Mikroskops auf einer hohen Ebene und bietet zusätzliche Hilfestellungen speziell zugeschnitten auf mikrofluidische Versuche. Dazu sind die Hardwaresteuerung des Mikroskops und zusätzlicher Peripherie, Bildanalyse und Fernsteuerung sowie entfernte Datenspeicherung in einer zentralen Software implementiert, gemeinsam mit Möglichkeiten zur Anbindung von Bildanalyseroutinen. Dies ermöglicht die direkte, automatische Bildanalyse während der Bildakquise. Die Ergebnisse werden direkt dem Nutzer zur Einflussnahme bereitgestellt, sowie an eine einfache, aber mächtige Skript-Schnittstelle weitergereicht, wobei die Ergebnisse zur modellgestützten Steuerung des Experiments dienen können. Des Weiteren wird ein Simulator zur synthetischen Bildgenerierung beschrieben, der reine in silico Testszenarien der Plattform ermöglichen kann und darüber hinaus Einblicke in Mikrokoloniewachstum bringen kann. In einer erfolgreichen Machbarkeitsstudie wurde das Wachstum des biotechnologisch relevanten Organismus Corynebacterium glutamicum durch Nährstoffverfügbarkeit reguliert. Somit legt die Experimentsteuerplattform, HiMiCs, das Fundament für neue Arten von Experimenten, und verkürzt die Zeit zum Erkenntnisgewinn: Anhand biologischen Verhaltens lassen sich Experimentbedingungen automatisch anpassen, und so den Zyklus aus Datengenerierung, Auswertung und Parameterauswahl innerhalb eines Experiments schließt.

Unraveling heterogeneity remains a major challenge to overcome when advancing our understanding of bio(techno)logical processes. Microfluidic single cell cultivation combined with live cell imaging has become a powerful technology to elucidate cellular heterogeneities temporally resolved on the single cell level. In this context, within recent years, versatile cultivation devices as well as image analysis tools have been developed, tailored to microbial single-cell studies. At the current state, acquired image data are typically analyzed after experimentation has been finished, resulting in static offline approaches and long cycles of insight generation. To shorten these cycles and to allow novel types of experiments extended by interacting with the biological system, the experimental setup needs live analysis with joint automated experimental control. This work develops software-based online capable techniques for feed-back experimentation: The application and development of image analysis pipelines suitable therefor, as well as the establishment of a new automated experimental control platform, HiMiCs, for microfluidic live cell experiments: An existing image analysis pipeline is described, aiming at one dimensional microfluidic growth channels. It is applied and connected into the platform. A new image analysis pipeline specifically aiming at filamentous growing microorganisms in cultivation chambers was developed and applied. Furthermore, a machine learning based approach for segmenting rod-shaped bacteria has been investigated. The experimental control platform connects high-level microscope control specifically tailored to the necessities of microfluidic experimentation, that is, hardware control of the microscope and additional peripherals, image acquisition and remote storage in centralized infrastructure, jointly with connectivity protocols for image analysis routines. This allows for direct, automated analysis of the image data, as it is acquired, presenting the user with results and remote control. By passing the results to a simple yet powerful scripting interface, model based steering of the experiment at a high abstraction level becomes possible. Furthermore, a simulation based image generation system is described, for in silico end-to-end testing scenarios of the platform, as well to gather insight towards microcolony growth by modeling. As a proof-of-concept experiment facilitating feed-back control, growth of the biotechnologically relevant organism Corynebacterium glutamicum is automatically controlled via nutrient availability. With that, the experimental control platform HiMiCs lays the foundation to new classes of experiments while reducing the “time to insight”: Based upon biological behavior, experimental conditions can be adapted automatically, thereby closing the cycle of data generation and experiment parameter decision within a single experiment.

OpenAccess:
PDF
(additional files)