Das Immunsystem der Nukleinsäureerkennung

Einleitung

Nukleinsäuren in zellfreien Kompartimenten des Blutes und in anderen Körperflüssigkeiten verbunden mit den aktuellen Sequenzierungstechniken eröffnen völlig neue Perspektiven für die Diagnostik in der Laboratoriumsmedizin [1], [2]. Das Fachgebiet der Laboratoriumsmedizin besitzt eine über viele Jahrzehnte gewachsene Expertise im Umgang mit diagnostischen Verfahren in Flüssigkeiten, und ist daher prädestiniert, sich dieser neuen Herausforderung anzunehmen und auf einem hohen Qualitätsstandard zu etablieren. Die Möglichkeiten und Perspektiven für Nukleinsäure-basierte Diagnostik aus Körperflüssigkeiten gehen dabei weit über die Mutationsanalyse von zirkulierender zellfreier DNA im Blut hinaus. Eine herausragende Rolle spielt in diesem Zusammenhang die Diagnostik aus zirkulierenden Exosomen [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Während zirkulierende zellfreie DNA in erster Linie aus toten Zellen freigesetzt wird, und daher die Konzentration im Blut bei Tumorerkrankungen mit der Rate des Untergangs von Tumorzellen in Verbindung steht, werden sogenannte Exosomen kontinuierlich auch von viablen Tumorzellen sezerniert. Zirkulierende Exosomen enthalten vor allem verschiedene Formen von RNA wie messenger RNA und microRNA. Wird die Mutationsanalyse im Blut um exosomale RNA erweitert, können Mutationen in Tumoren mit größerer Treffsicherheit identifiziert werden, da letztlich sowohl viable wie tote Zellen in die Analyse mit einbezogen werden. Eine Anreicherung von Tumor-Exosomen in exosomalen Präparationen kann die Sensitivität weiter erhöhen. Zudem kann das RNA-Expressionsmuster in Tumor-Exosomen Hinweise für weitere biologische Eigenschaften des Tumors liefern, wie beispielsweise Marker die auf Immunsuppression hindeuten, wie z.B. PD1, TGF-β oder IL-10, und darüber wiederum die Therapieentscheidung beeinflussen können. Interessanterweise konnte aber auch gezeigt werden, dass die RNA-Expression in anderen Blutbestandteilen wie z.B. Thrombozyten Hinweise auf das Vorliegen einer Tumorerkrankung und auch auf die Entität des Tumors liefern kann [9]. Mit der aktuellen Verbesserung der Analyseverfahren ist auch absehbar, dass die RNA Expressionsprofile in den zellulären Bestandteilen, insbesondere den verschiedenen Immunzellpopulationen, Rückschlüsse auf das Vorliegen und den Verlauf von Erkrankungen ziehen lassen. Die diagnostischen Möglichkeiten gehen daher weit über die Onkologie hinaus. Es ist zu erwarten, dass die Expression von RNA in verschiedenen Kompartimenten im Blut und anderen Körperflüssigkeiten Rückschlüsse beispielsweise auf entzündliche Autoimmunerkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Diabetes, neurodegenerative Erkrankungen und Infektionen erlauben wird. Diese sich abzeichnenden neuen diagnostischen Möglichkeiten können nur über die Qualitätsstandards und die spezielle Expertise für Flüssigkeiten in der Laboratoriumsmedizin für die Routinediagnostik etabliert werden, und eröffnen dem Fachgebiet umfangreiche neue akademische Aufgaben.

Ein umfangreiches Verständnis der biologischen Eigenschaften von Nukleinsäuren ist eine wichtige Voraussetzung, um Nukleinsäure-basierte Diagnostik in Flüssigkeiten zu entwickeln. Eine wichtige Einflussgröße sind die verschiedenen Nukleasen im Blut und in anderen Flüssigkeiten. Weitere Einflussgrößen sind strukturelle Merkmale von Nukleinsäuren, wie deren Einzel- und Doppelträngigkeit, der Sekundärstruktur, der molekularen Konfiguration der 5′- und 3′- Enden der Nukleinsäuren, und der Modifikationen der Zucker und der Basen. Neben der Sequenzinformation besitzen diese strukturellen Merkmale eine große Bedeutung für die Nukleinsäurediagnostik, da sie Eigenschaften und Funktion der Nukleinsäuren mit bestimmen. Das Immunsystem hat eine Reihe von Mechanismen entwickelt, fremde von eigenen Nukleinsäuren anhand struktureller Merkmale zu unterscheiden. Hier hat sich das neue Gebiet der Nukleinsäure-Immunität etabliert [10]. Hier soll eine Übersicht über dieses Forschungsfeld gegeben, und die Bedeutung dieser Erkenntnisse für die Nukleinsäurediagnostik dargestellt und diskutiert werden.

Das Immunsystem wird im Allgemeinen unterteilt in das angeborene (innate) und das erworbene (adaptive) Immunsystem. Die Besonderheit des erworbenen Immunsystems besteht in der Fähigkeit, Rezeptoren während des Lebens neu zu bilden, die exakt auf bestimmte Proteinstrukturen passen. Dies geschieht über den Mechanismus der Rekombination, bei der verschiedene Gen-Abschnitte neu miteinander verknüpft werden, und die daraus resultierende neue genetische Information dann in ein entsprechend neues Protein umgeschrieben wird, dem neuen Rezeptor, der eine bestimmte Proteinstruktur mit hoher Spezifität erkennt. Im Immunsystem sind es die T-Zellen und die B-Zellen, die die Fähigkeit zur Rekombination und klonalen Selektion besitzen. Die resultierenden Rezeptoren sind die T-Zell-Rezeptoren (TCR) und die B-Zell-Rezeptoren (BCR) bzw. die dann sezernierten Antikörper. Während dieser Teil des Immunsystems so ein ausgeklügeltes System für die Erkennung von neuen Proteinstrukturen vorhält, mit denen der Körper noch nie vorher in Kontakt war, basiert das angeborene Immunsystem auf Rezeptoren, die bereits genetisch angelegt sind, und in der Regel hochkonservierte molekulare Strukturen erkennen, die auf das Eindringen von Krankheitserregern hinweisen. Ein Beispiel ist Lipopolysaccharid (LPS) in der Zellwand von Gram-negativen Bakterien. Der Immunrezeptor TLR4 (Toll-like Rezeptor 4) ist in der Lage, LPS spezifisch zu erkennen. Neben TLR4 gibt es eine Reihe weiterer Rezeptoren, die als Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors) bezeichnet werden, und die Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns) erkennen. Die Rezeptoren werden Rezeptorfamilien zugeordnet, wie z.B. die Toll-like Rezeptoren, Lectin-like Rezeptoren, Nod-like Rezeptoren, RIG-I-like Rezeptoren, und andere.

Proteine und Nukleinsäuren sind beide ganz grundsätzliche Bausteine allen Lebens. Ähnlich wie Proteine unterliegen auch Nukleinsäuren einer fast unbegrenzten molekularen Variabilität. Über alle Lebensformen von Bakterien über Vielzeller bis zum Menschen bedeutet das Eindringen fremder Nukleinsäuren Gefahr. Das Abwehren dieser Gefahr durch fremde Nukleinsäuren ist daher eine der ureigensten Aufgaben des Immunsystems. Die Biologie hat auf allen Stufen der Evolution Mechanismen etabliert, die ein gezieltes Erkennen und Eliminieren von fremden Nukleinsäuren ermöglichen, und die in ihrer Gesamtheit heute als Nukleinsäure-Immunität bezeichnet werden. Dabei gehen diese Mechanismen über die eigentlichen Immunzellen wie Monozyten, Granulozyten, T-Zellen usw. hinaus. Alle Zellen im Körper sind in der Lage, fremde Nukleinsäuren zu erkennen, und entsprechende Abwehrmechanismen einzuleiten. Dennoch sind bestimmte Immunzellen wie z.B. die plasmazytoide dendritische Zelle, darauf spezialisiert, fremde Nukleinsäuren zu detektieren, und die Sensitivität der Nukleinsäure-Immunerkennung in anderen Körperzellen zu steuern.

Grundzüge der Immunerkennung von Nukleinsäuren

Die molekulare Grundstruktur von DNA und RNA ist universell, von Bakterien bis hin zu Wirbeltieren. Daher kann die Erkennung von fremder DNA und RNA nicht nach den Prinzipien der molekularen Mustererkennung erfolgen, wie beispielsweise bei fremden Molekülstrukturen wie LPS. Dennoch hat das Immunsystem Prinzipien entwickelt, die eine Erkennung von fremden Nukleinsäuren mit hoher Treffsicherheit erlauben. Hierzu werden dreierlei Informationen integriert: die Verfügbarkeit der Nukleinsäuren für eine Erkennung, die Lokalisation der Nukleinsäure, und bestimmte strukturelle Komponenten (Abbildung 1). Die Verfu˧barkeit der Nukleinsäuren fu˲ eine Immunerkennung wird durch deren Konzentration, der Nukleaseaktivität und der Komplexierung der Nukleinsäure an weitere Komponenten wie Proteine bestimmt. Die Komplexierung an Proteine hat wiederum Einfluss auf die Stabilität und Erkennbarkeit der Nukleinsäure. Die Lokalisation außerhalb der Zelle, im endolysosomalen Kompartment der Zelle, im Zytosol oder im Zellkern trägt Information bei, ob es sich um Nukleinsäure im physiologischen Zellkontext handelt, oder um Nukleinsäure, die an diesen Orten ungewöhnlich ist. Auch besondere strukturelle Merkmale tragen zur Erkennung von Nukleinsäuren bei, auch wenn die grundsätzliche molekulare Struktur von DNA und RNA bei allen Organismen identisch ist. Dabei werden einerseits von der Zelle selbst strukurelle Merkmale in die Nukleinsäure eingebaut, die als Signatur für selbst-Nukleinsäure benutzt werden; andererseits gibt es bestimmte strukturelle Merkmale, die bei Wirbeltieren in bestimmten zellulären Kompartimenten nicht vorkommen, und daher auf fremde Nukleinsäuren hinweisen. Ein Beispiel hierfür ist lange Doppelstrang-RNA. Spezialisierte Immunrezeptoren erkennen fremde Nukleinsäuren anhand der Informationen aus diesen drei Bereichen Verfügbarkeit, Lokalisation und Struktur. Dies führt dann im Fall der Erkennung von fremder Nukleinsäure zur Aktivierung dieser Rezeptoren und der nachfolgenden Signalwege. Die resultierende Immunantwort ist gegen eindringende fremde Nukleinsäuren gerichtet, also in der Regel Viren oder intrazelluläre Bakterien. Charakteristisch ist die Induktion von Typ-I-Interferon (IFN-α und IFN-β) und einem breiten Spektrum von IFN-induzierbaren Genen. Weiterführende Informationen zur Immunerkennung von eigener vs. fremder Nukleinsäure sind in folgendem Übersichtsartikel aktuell zusammengefasst [11].

Abbildung 1:

Prinzip der Immunerkennung von Nukleinsäuren.

Fremde Nukleinsäuren beispielsweise von Pathogenen besitzen zumeist keine exakten strukturellen Merkmale, die eine sichere Erkennung ermöglichen. Daher spielen bei der Immunerkennung immer mehrere Informationen zusammen, um im besten Fall zu einer eindeutigen Entscheidung zu fremd versus selbst zu gelangen. In die Entscheidung werden Informationen zu Verfügbarkeit, Lokalisierung und Struktur der Nukeinsäuren integriert. Die Erkennung durch Immunrezeptoren führt dann zur Induktion einer antiviralen Immunantwort wie die Produktion von Interferon α und Interferon-β, und von Interferon-induzierten Genen.

Rezeptoren der Immunerkennung von Nukleinsäuren

Rezeptoren der Nukleinsäureerkennung sind auf der Zellmembran, in der endolysosomalen Membran, oder im Zytosol von Immunzellen und von somatischen Zellen lokalisiert (Abbildung 2). Vier Vertreter aus der Familie der Toll-like-Rezeptoren tragen beim Menschen zur Immunerkennung von Nukleinsäuren bei: TLR3 auf der Zellmembran, und TLR7, TLR8 und TLR9 in der endolysosomalen Membran. Im Zytosol sind die beiden Vertreter der RIG-I-like Rezeptoren, RIG-I und MDA5 lokalisiert. Weiterhin befindet sich cGAS im Zytosol. Alle bis heute bekannten Mechanismen der Immunerkennung von DNA und RNA und nachfolgender Induktion von Typ I IFN werden von diesen sieben Rezeptoren gesteuert. AIM2, ein weiterer Rezeptor im Zytosol, resultiert nicht in der Induktion von Typ I IFN, sondern in der Aktivierung des sogenannten Inflammasoms mit Freisetzung von IL-1β. Es gibt eine Reihe von weiteren Rezeptoren der Nukleinsäureerkennung, die jedoch nicht zu Immunantworten führen, sondern direkte antivirale Effektormechanismen auslösen, wie die Degradation oder den molekularen Umbau von zytosolischer RNA (e.g. OAS, ADAR1) und der allgemeinen Hemmung der Proteinsynthese (e.g. PKR). Eine weitere Wirkung der Nukleinsäurebindung an diese Rezeptoren der Effektorantwort kann wiederum auch eine Steigerung der Sensitivität der anderen Immunrezeptoren sein.

Abbildung 2:

Immunrezeptoren der Nukleinsäureerkennung.

Das angeborene Immunsystem besitzt eine definierte Zahl Rezeptoren, die an der Erkennung von Molekülen beteiligt sind, die auf ein Pathogen oder eine mögliche Gefahr oder Zellschaden hinweisen. An der Immunerkennung von Nukleinsäuren sind insbesondere TLR3 auf der Zellmembran, TLR7, TLR8 und TLR9 auf der endolysosomalen Membran, und im Zytosol die RIG-I-like Rezeptoren RIG-I und MDA5, sowie cGAS und AIM2 beteiligt.

Mechanismen der Immunerkennung von RNA

Im Zytosol eukaryotischer Zellen ist die Anwesenheit von RNA physiologisch. RNA wird einerseits dann von Immunrezeptoren erkannt, wenn sich diese im endolysosomalen Kompartment der Zelle befindet, oder wenn die RNA bestimmte chrakteristische Merkmale aufweist, oder eine Kombination aus beidem. Lange Doppelstrang RNA kommt in normalen Zellprozessen kaum vor, und wird daher von verschiedenen Rezeptoren als charakteristisches Merkmal für fremd-RNA verwendet. TLR3 befindet sich an der Zellmembran und in der endolysosomalen Membran von myeloiden Immunzellen und einer Reihe von somatischen Zellen wie Fibroblasten und Endothelzellen. Neben TLR3 ist der RIG-I-like Rezeptor MDA5 im Zytosol der meisten Zellen exprimiert. TLR3 und MDA5 erkennen lange dsRNA, TLR3 ab einer Länge von etwa 35 Basenpaaren, und MDA5 deutlich längere dsRNA, besonders effektiv ab einer Länge von etwa 300 bis 500 Basenpaaren (Abbildung 3). Deutlich kürzere Doppelstrang RNA wird von RIG-I im Zytoplasma erkannt. Hier reichen etwa 20 Basenpaare aus, aber es müssen zusätzliche strukturelle Merkmale vorhanden sein: das Ende muss glatt sein, d.h. ohne Überhänge (blunt), und am 5′Ende muss ein Triphosphat oder ein Diphosphat lokalisiert sein. Solche Strukturen sind beispielsweise charakteristisch für Negativstrang-RNA Viren. Prinzipiell wird über dieses strukturelle Merkmal das Vorhandensein einer RNA Polymerase-Aktivität im Zytosol detektiert, denn jede Form der RNA Synthese über Polymerase hinterlässt eine Triphosphat-Gruppe am 5′-Ende der RNA. Physiologischerweise erfolgt die Neubildung von RNA über die zellulären Polymerasen im Zellkern, und die so gebildete RNA wird prozessiert (sog. capping, splicing, 2′-O-Methylierung) bevor diese in das Zytosol gelangt. So wird die Erkennung von „selbst“ RNA durch RIG-I effektiv verhindert. Ein zusätzlicher Mechanismus, der sicherstellt, dass „selbst“ RNA nicht erkannt wird, wurde kürzliche identifiziert: „selbst“ RNA wird im Kontext des sogenannten capping Prozesses an der ersten Position (N1) am 5′-Ende mit einer Methylgruppe markiert. Eine solche Methylgruppe schließt eine Erkennung durch RIG-I vollständig aus [12]. Die eigentliche cap-Gruppe (N7-methyl-guanosine) am 5′-Ende von RNA verhindert die Erkennung durch RIG-I hingegen nicht. Cap und N1-Methylierung sind charakteristisch für die seit langem bekannte cap1 Struktur von eukaryotischer mRNA. Während die Funktion der cap-Gruppe selbst schon lange bekannt war (Verstärkung der ribosomalen Translation), war die Funktion der N1-Methylierung (Markierung von RNA als „selbst“) lange unklar.

Abbildung 3:

Immunerkennung von Doppelstrang-RNA.

Doppelstrang-RNA ist ein wichtiges Merkmal bei der Erkennung von fremder RNA. Die Erkennung durch die beteiligten Rezeptoren RIG-I, TLR3 und MDA5 ist längenabhängig. MDA5 benötigt lange Abschnitte von dsRNA (>500 bp). TLR3 wird bereits durch dsRNA von etwa 35 bp aktiviert. RIG-I erkennt auch sehr kurze Abschnitte von dsRNA, diese benötigen dann aber ein glattes Ende (blunt end) und am 5′-Ende eine Triphosphat-Gruppe. RIG-I und MDA5 befinden sich im Zytosol, während TLR3 auf der endosomalen und der Zellmembran lokalisiert ist.

Grundsätzlich besitzen aber die meisten pathogenen Viren Mechanismen die Immunerkennung zu umgehen. So versuchen Viren beispielsweise, cap1-Strukturen von zellulärer RNA abzuschneiden und an die eigene RNA zu hängen, oder ihre RNA über eine Virus-eigene Methyltransferase zu methylieren, was nicht nur die Erkennung durch RIG-I sondern auch durch TLR7 einschränkt [13]. So erscheint die virale RNA als „selbst“ RNA und bleibt unerkannt. RNA wird auch über TLR7 und TLR8 detektiert. Beide sind in der endolysosomalen Membran von Immunzellen exprimiert, und detektieren RNA, die sich im endolysosomalen Kompartment befindet. TLR7 ist dabei vor allem in B-Zellen und plasmazytoiden dendritischen Zellen exprimiert, TLR8 vor allem in myeloiden Immunzellen, also Makrophagen, Monozyten und myeloiden dendritischen Zellen. Wichtig ist auch hier die besondere Spezies-Spezifität, die sich darin zeigt, dass TLR8 beispielsweise in der Maus nicht funktionell aktiv ist, und TLR7 hier über die Expression auch in myeloiden Immunzellen die Aufgaben von TLR8 teilweise mit übernimmt. Das Erkennungsmerkmal für fremd bei TLR7 und TLR8 ist die Lokalisation im endolysosomalen Kompartment. Als zusätzliches strukturelles Merkmal wird das Fehlen von 2′O-Methylierung genutzt, eine Modifikation die die eukaryotische Zelle im Nukleolus an eigene RNA als Marker für „selbst“ einfügt [14], [15], [16], [17]. Zudem wird die Stabilität von RNA genutzt: RNA wird im endolysosomalen Kompartment in der Regel rasch über Nukleasen abgebaut. Nur wenn die RNA über beispielsweise Bindung an Proteine gegenüber Abbau stabilisiert ist, kommt es zur Erkennung. Dies kann künstlich über die Komplexierung an kationische Proteine oder kationische Lipide erreicht werden. Diese Komplexierung ist in der der Regel notwendig um eine immunstimulatorische Aktivität von exogen applizierter RNA nachzuweisen.

Mechanismen der Immunerkennung von DNA

DNA ist unter physiologischen Bedingungen auf den Zellkern begrenzt. Eine Lokalisation im Zytosplasma wird vom Immunsystem als Hinweis auf fremde DNA gewertet. Im Zytosol sind zwei Rezeptoren für die Detektion von „fremd“ DNA entscheidend, cGAS (cyclic guanosine adenine synthetase) und AIM2 (absent in melanoma 2). Bei cGAS handelt es sich um ein Enzym, das bei Bindung an Doppelstrang-DNA eine biochemische Reaktion katalysiert, die ATP und GTP zu einem zyklischen Dinukleotid verknüpft, dem sog. cGAMP (cyclic guanosine adenine monophosphate) (Abbildung 4). Sowohl cGAS als auch das resultierende Dinukleotid wurden erst vor wenigen Jahren entdeckt [18]. Das Besondere an cGAMP ist, dass es der erste Vertreter einer neuen Klasse von Signalmolekülen ist, die bislang völlig unbekannt war. Im humanen System besitzt cGAMP eine ungewöhnliche 2′-5′-Verknüpfung zwischen dem Guanosin und dem Adenin, und eine konventionelle 3′-5′-Verknüpfung zwischen dem Adenin und dem Guanosin [19], [20]. Das Vorhandensein einer 2′-5′-Verknüpfung ist speziesspezifisch, und besitzt eine besondere Bedeutung beim Menschen. Erst die Identifizierung dieses Moleküles erlaubt den Einsatz zur Aktivierung dieses Pathways beim Menschen [20] (Aduro Biosciences; Tabelle 1). Die Spezifität wird dabei über das nachfolgende Signalmolekül Sting bestimmt, das cGAMP bindet, und dann für die Induktion der antiviralen Signalwege verantwortlich ist. Sting wiederum erkennt auch zyklische Dinukleotide, die von intrazellulären Bakterien stammen, die diese Art von zyklischen Dinukleotiden als physiologische Signalmoleküle für verschiedene Bakterien-eigene Zellprozesse benutzen. Sting hat so eine duale Funktion: es ist einerseits zentral in die Erkennung von DNA im Zytosol eingebunden, andererseits spielt bitte streichen es eine wichtige Funktion in der Erkennung von intrazellulären Bakterien. Ähnlich wie die RIG-I-like Helikasen sind auch cGAS und Sting in vielen Zellpopulationen exprimiert, präferentiell aber in myeloiden Immunzellen. Die Regulation der Expression in anderen Zelltypen ist nicht vollständig geklärt, unterliegt aber auch der Induktion durch Typ I-IFN.

Abbildung 4:

Immunerkennung von DNA durch cGAS und Weiterleitung zum Signalmolekül Sting.

Längere Abschnitte von Doppelstrang-DNA werden von cGAS erkannt. Die Erkennung führt zu einer katalytischen Aktivität, die aus ATP und GTP ein zyklisches Dinukleotid generiert, cGAMP. Dieses wiederum bindet an das Signalmolekül Sting, das dann für die Induktion von Typ I Interferon (IFN-α und IFN-β) verantwortlich ist.

Neben cGAS ist der Immunrezeptor AIM2 in die Erkennung von DNA im Zytosol involviert [25]. AIM2 gehört zu den Rezeptorproteinen des sogenannten Inflammasoms. Bei Bindung von DNA assoziiert AIM2 mit dem Signalmolekül Asc, was zur Aktivierung von Caspase I und der damit verbundenen Freisetzung von IL-1β führt. Ein weiterer Effekt ist die Induktion der Apoptose, also des geregelten Zelltods. So führt die Detektion von DNA im Zytosol zur Aktivierung von zwei Immunrezeptoren, cGAS (Typ I IFN) und AIM2 (Inflammasom). Die wechselseitige Steuerung bzw. Kompetition der beiden Rezeptoren um denselben Liganden ist noch nicht eindeutig geklärt. Kürzlich wurde aber entdeckt, dass nicht nur lange Doppelstrang-DNA zur Aktivierung von cGAS führt, sondern auch Einzelstrang-DNA, die sich zu kurzen Doppelstrang-DNA Abschnitten zusammenlagert, jeweils von freien ungebundenen Einzelstrang-DNA Bereichen flankiert und zumindest ein Guanosin enthaltend [26]. Diese Strukturen sind besonders häufig in Retroviren wie HIV zu finden, die aus ihrem RNA-Genom zunächst Einzelstrang-DNA bilden.

Neben der Erkennung von DNA im Zytosol wird DNA auch über TLR9 im endolysosomalen Kompartment von B-Zellen und plasmazytoiden dendritischen Zellen detektiert. Die Selektivität dieser beiden Zellarten für die TLR9-vermittelte Erkennung ist vor allem beim Menschen ausgepägt, während beispielsweise in der Maus TLR9 auch in myleoiden Immunzellen exprimiert wird. Dies unterstreicht nochmals die Bedeutung der Spezies-Spezifität der Immunerkennung von Nukleinsäuren, aber auch die unterschiedliche Funktion der Rezeptoren des angeborenen Immunsystems in verschiedenen Spezies. Neben der Lokalisierung im endolysosomalen Kompartment nutzt TLR9 noch zusätzliche strukturelle Merkmale: die Einzelsträngigkeit, und die Anwesenheit von sogenannten unmethylierten CpG-Motiven. Die Häufigkeit von unmethylierten CpG-Motiven, also unmethylierte CG Dinukleotide in bestimmten Sequenzzusammenhängen, ist bei Wirbeltieren sehr viel niedriger als bei Bakterien und Viren. Daher kann die Häufigkeit von unmethylierten CpG-Motiven in DNA vom Immunsystem als zusätzlicher Hinweis auf „fremd“ DNA eingesetzt werden [27], [28].

Nukleinsäure-Liganden zur Aktivierung antiviraler Signalwege

Lange Doppelstrang-RNA ist schon seit den 1970er Jahren als Stimulus für Typ I IFN bekannt, der Mechanismus war aber lange unklar. Verwendet wurde dafür in erster Linie poly(I:C), ein Doppelstrang gebildet aus Einzelsträngen von poly-Inosin und poly-Cytidin. Poly(I:C) wurde in zahlreichen klinischen Studien eingesetzt, besitzt aber insgesamt eine hohe Immuntoxizität. Mittlerweile sind die Gründe hierfür bekannt. Lange Doppelstrang-RNA in der Form von poly(I:C) aktiviert TLR3, MDA5, RIG-I und die dsRNA-bindenen Effektorproteine PKR, OAS und ADAR1. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass 5′-Diphosphat-Enden in poly(I:C), die der speziellen Herstellung des Moleküls geschuldet sind, für die zusätzliche Aktivierung über RIG-I verantwortlich sind [29]. Solche 5′-Dinukleotid Enden sind charakteristisch für manche Viren (e.g. Reoviren). In der Summe verursacht die parallele Aktivierung all dieser Rezeptoren die beobachtete hohe Immuntoxizität von poly(I:C), die den therapeutischen Einsatz limitiert. Aktuell befinden sich veränderte Formen von poly(I:C) in der klinischen Entwicklung, die ein günstigeres Toxizitätsprofil aufweisen (Tabelle 1).

Im Gegensatz zur RIG-I-like helicase MDA5 (lange dsRNA Erkennung) ist bei RIG-I eine selektive Aktivierung möglich. Hierzu werden kurze (20–24mer) synthetische dsRNA Oligonukleotide mit einem 5′-Triphosphat eingesetzt [30], [31]. Die TLR7-Aktivität solcher Oligonukleotide kann über gezielte Methylierung eliminiert werden, so dass der resultierende Ligand hochspezifisch ist. Über weitere chemische Modifikation kann die Stabilität dieser RIG-I-Oligonukleotid-Liganden gegenüber Nukleasen erhöht werden. Die so etablierten RIG-I-Oligonukleotid-Liganden besitzen besonders günstige Eigenschaften, die für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen eingesetzt werden können. Anders als bei anderen Immunstimuli, die bislang verwendet wurden, wie LPS, ist RIG-I nicht nur in Immunzellen sondern auch direkt in Tumorzellen exprimiert. Die Aktivierung in Tumorzellen führt zur Produktion von Typ I-IFN und Chemokinen durch die Tumorzellen selbst. Zusätzlich wird Apoptose ausgelöst, während normale gesunde Zellen RIG-I zwar auch exprimieren, aber gegenüber der RIG-induzierten Apoptose-Induktion unempfindlich sind [32]. Daher kann die Aktivierung von RIG-I über intratumorale Applikation in das Tumorgewebe das Tumormikromilieu von der Tumor-induzierten Immunsuppression hin zu einem immunstimulatorischen Milieu verändern, das dann die zytotoxische Aktivität von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen und von NK-Zellen fördert. Die präklinischen Untersuchungen zeigen eine ausgeprägte Aktivität in verschiedenen murinen Tumormodellen, die auf einer frühen NK-Zell-Aktivierung und einer sich daran anschließenden T-Zell-Aktivierung basiert. Die klinische Entwicklung wird durch die Biotech Firma Rigontec GmbH vorangetrieben (Tabelle 1). Durch die ausgeprägte Induktion von antiviralen Mechanismen kann die Aktivierung von RIG-I auch für die Entwicklung RIG-I-basierten Therapeutika für Virusinfektionen wie Influenza oder Hepatitis B eingesetzt werden.

Im Gegensatz zu RIG-I ist die Aktivierung von TLR9 im humanen System auf zwei Zelltypen begrenzt, die B-Zelle und die plasmazytoide dendritische Zelle. CpG-Oligonukleotide gehören zu den potentesten Adjuvantien der humoralen Immunantwort, bei der die Aktivierung der plasmazytoiden dendritischen Zelle die direkte Aktivierung der B-Zelle weiter steigert. Die klinische Entwicklung eines CpG-Oligonukleotids als Adjuvans der humoralen Immunantwort steht nach Abschluss der Phase III-Studie kurz vor der erwarteten Zulassung (Dynavax, Hepatitis B, Tabelle 1). Weitere CpG-Oligonukleotide befinden sich in der klinischen Entwicklung (Tabelle 1). Wegen der Begrenzung der Wirkung von CpG-Oligonukleotiden auf B-Zellen und plasmazytoide dendritische Zellen ohne Steigerung der NK-Zell-Zytotoxizität blieb die klinische Anwendung in der Immunonkologie bislang erfolglos. Insbesondere CpG-A-Oligonukleotide [33] werden aber aktuell als Adjuvans für Tumor-Antigen-spezifische Vakzine-Ansätze weiter verfolgt, insbesondere in Verbindung mit den sogenannten Checkpoint (PD1/PD-L1)-Inhibitoren (Checkmate Pharmaceuticals Inc.).

Oligonukleotid-Liganden für die Aktivierung von TLR7 und TLR8 sind aussichtsreich, haben aber das Stadium der klinischen Entwicklung noch nicht erreicht. Bislang wurden small molecule Liganden für TLR7 und TLR8 klinisch entwickelt. Einer dieser Liganden, Imiquimod (Aldara®), ist in der topischen dermalen Applikationsform (Creme) seit einigen Jahren für die Therapie der aktinischen Keratose, des Basalzellkarzinoms und von HPV-induzierten Warzen zugelassen. Einige small molecule Agonisten von TLR7 und TLR8 befinden sich derzeit in klinischer Entwicklung für topische Applikationsformen (Tabelle 1). Die systemische Verabreichungsform von small molecule Liganden erwies sich allerdings als zu toxisch, da small molecule Liganden neben der TLR-Aktivierung noch weitere Effekte auslösen, die eine hohe Toxizität verursachen. Daher rückt die Entwicklung von selektiven Oligonukleotid-Liganden für die spezifische Aktivierung von TLR7 und TLR8 wieder in den Vordergrund des Interesses.

Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Vermeidung der Immunerkennung bei Oligonukleotid-basierten therapeutischen Ansätzen, die die gezielte Hemmung der Genexpression und Translation über einen Antisense-Mechanismus zum Ziel haben. Hierzu zählen Antisense-DNA-Oligonukleotide, und siRNA (short interfering RNA). Bei Antisense-Oligonukleotiden muss die Immunerkennung über TLR9 umgangen werden durch Vermeidung entsprechender immunstimulatorischer Motive. Bei der therapeutischen Anwendung von siRNA stellt die Immunerkennung über TLR7 einen Risikofaktor für unerwünschte immunstimulatorische Effekte dar, die über das Einbringen von 2′-O-Methylgruppen in die RNA eliminiert werden können.

Weitere Mechanismen der Nukleinsäureimmunität in der Evolution

Mechanismen zur Abwehr fremder Nukleinsäuren sind in der Evolution viel älter als die vergleichweise jungen Mechanismen des adaptiven Immunsystems zur spezifischen Erkennung von Proteinen (Rekombination in T-Zellen und B-Zellen). Bereits Bakterien haben Verfahrenentwickelt, fremde Nukleinsäuren zu erkennen und zu eliminieren, das prokaryotische DNA-Restriktions-Modifikations (R-M)-System. Dieses basiert auf einer Sequenz-Motiv-spezifischen Restriktionsendonuklease (REase) und einer Methyltransferase (MTase), die an das gleiche Sequenzmotiv bindet wie die Restriktionsendonuklease [34]. Die MTasen des Bakteriums schützen die DNA vor der Rease-Aktivität für das gleiche Sequenzmotiv. Nicht-methylierte fremde DNA beispielsweise von Bakteriophagen (Viren von Bakterien), die nicht in gleicher Weise methyliert ist, wird so spezifisch erkannt und geschnitten. Während Restriktionsenzyme seit vielen Jahren bekannt sind, wurde erst vor wenigen Jahren ein neues Nukleinsäure-Abwehrsystem von Bakterien entdeckt, das CRISPR/Cas-Nukleasen-System. Dieses System ermöglicht, Sequenzinformationen von fremden Nukleinsäuren (Bakteriphagen) aufzunehmen und als komplementäre Sequenzen im eigenen Genom gezielt in einer hochorganisierten Form abzulegen. Diese Sequenzen können dann wieder abgeschrieben und als Matrize eingesetzt werden, um die Anwesenheit komplementärer Sequenzen in der Zelle aufzuspüren. Ein damit verbundenes Nuklease-System (Cas) spaltet dann diese komplementären fremden Nukleinsäuren hochspezifisch. Damit haben Bakterien eine Art adaptives Immunsystem für die Abwehr von fremden Nukleinsäuren verfügbar. Ebenso wie das Restriktionsenzym-System hat auch das CRISPR/Cas-System bereits breiten Eingang in die Molekularbiologie und Zellbiologie gefunden, und ist mittlerweile unverzichtbar für die Herstellung von hochspezifisch genetisch veränderten Zellen und Organismen.

Bei höheren Organismen wie Würmern, Insekten und Pflanzen sind Nukleinsäure-Abwehrfunktionen auf ein anderes System übergegangen, das System der RNA Interferenz (RNAi). Fremde Doppelstrang RNA, die bei Replikation der meisten Viren entsteht, wird von der Helikase Dicer in kleine dsRNA-Stücke geschnitten (etwa 20mer, siRNA) und teilweise auch über Polymerasen amplifiziert. Einer der Stränge wird dann in den RISC-Komplex eingebunden, und fungiert wiederum als komplementäre Matrize, um komplementäre Sequenzen in der Zelle aufzuspüren und zu spalten. Bei Würmern wurde gezeigt, dass die siRNA auch von Zelle zu Zelle, und sogar über Generationen, weitergegeben werden kann. Damit besteht in diesen Organismen ein adaptives Nukleinsäure-Abwehrsystem mit Gedächtnisfunktion für vergangene virale Infektionen.

Bei Vertebraten ist dieses System in abgewandelter Form und Funktion als microRNA vorhanden. Die microRNA ist im Genom fest verankert, und besitzt eine zentrale Funktion bei der Genregulation. Dicer schneidet auch im Vertebraten-System lange Doppelstrang-RNA, es fehlt jedoch der Amplifikationsschritt über Polymerasen, so dass dieses System in Vertebraten bei der antiviralen Abwehr eine untergeordnete Rolle spielt. Bei Vertebraten haben zwei zu Dicer verwandte Helikasen die ursprünglich mit RNAi verbundene immunologische Aufgabe übernommen, RIG-I und MDA5. Diese binden ebenfalls an dsRNA, aber die Konsequenz ist nicht die Spaltung dieser RNA, sondern die Aktivierung einer antiviralen Abwehr, die auf dem Typ I IFN-System basiert. Daher besitzen bei Vertebraten die RIG-I-like Helikasen eine ganz zentrale Bedeutung in der Abwehr von Virusinfektionen, und ersetzen damit die antivirale Funktion von RNAi in primitiveren Organismen (Würmer, Pflanzen, Insekten).

Relevanz für die Diagnostik zirkulierender Nukleinsäuren und neue Therapieansätze

Erst durch die Forschung der letzten Jahre sind nun umfassende Informationen verfügbar, nach welchen Kriterien die Unterscheidung von fremden und eigenen Nukleinsäuren im Organismus erfolgt. Dieses Wissen kann nun eingesetzt werden, um im Blut Nukleinsäuren zu identifizieren, die vom Immunsystem als fremd erkannt werden. Dies können eigene Nukleinsäuren sein, die fälschlicherweise als fremd erkannt werden, oder tatsächlich fremde Nukleinsäuren. Diese Nukleinsäuren können sich in unterschiedlichen Kompartimenten im Blut befinden, beispielsweise in Form von Protein-Antikörper-Komplexen als Nukleosomen, als Bestandteil von Exosomen und Mikrovesikeln, oder frei zirkulierend. Eine Trennung in diese Kompartimente vor Spezifizierung der darin enthaltenen Nukleinsäuren wird die Aussagekraft der Nukleinsäurediagnostik sicher deutlich erhöhen. Um Nukleinsäureliganden für Immunrezeptoren im Blut zu differenzieren sind funktionelle Assays notwendig, die nachweisen, ob und in welcher Form Nukleinsäure-Liganden für Immunrezeptoren im Blut vorhanden sind. Zusätzliche Information steuert die strukturelle Analyse der Nukleinsäuren bei (Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-RNA, Methylierungsstatus, weitere Modifikationen der Zucker und der Basen, und Phosphorylierung der Enden der Nukleinsäuren). Da die Immunerkennung von Nukleinsäuren zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen beiträgt, wie beispielsweise dem Lupus erythematodes, ist zu erwarten, dass die immunologischen Nukleinsäurediagnostik einen wichtigen Beitrag zur Diagnostik und Klassifizierung von Autoimmunerkrankungen leisten wird. Neben der Nukleinsäurediagnostik selbst sind aber auch die immunologischen Reaktionsmuster, die auf stimulierende Nukleinsäure-Liganden zurückgehen, von großer diagnostischer Relevanz. Beispiele hierfür sind Typ I IFN-induzierte Biomarker in Immunzellen und Geweben, einschließlich der Expression der Rezeptoren der Immunerkennung von Nukleinsäuren in verschiedenen Zellpopulationen im Blut und in Geweben [35]. Hier ist auch ein diagnostischer Beitrag zur Differenzierung von verschiedenen Formen von Virusinfektionen und bakteriellen Infektionen zu erwarten.

Die Mechanismen der Nukleinsäure-Immunität werden auch in einer Reihe von therapeutischen Ansätzen verfolgt. Beispielsweise werden Oligonukleotide, längere Nukleinsäuren oder auch kleine Moleküle eingesetzt, um Immunrezeptoren der Nukleinsäureerkennung gezielt zu aktivieren, und die so induzierte Immunantwort für die Therapie von Tumoren oder Infektionserkrankungen oder auch als Vakzine-Adjuvans einzusetzen.

Ein aktuelles Beispiel ist die Translation von RIG-I-Liganden aus der Grundlagenforschung in die klinische Anwendung [22]. Hier werden kurze Doppelstrang-RNA Oligonukleotide eingesetzt, die eine Triphosphat-Gruppe am 5′-Ende der RNA (3pRNA) enthalten. Diese 3pRNA stimuliert eine sehr selektive Form einer Immunantwort nach dem Muster einer antiviralen Antwort (Typ I Interferon) entspricht. Über die RIG-I Aktivierung in den Tumorzellen selbst werden die Tumorzellen in den immunogenen Zelltod getrieben [36], während gesunde Zellen gegenüber einer selektiven RIG-I Stimulation vergleichweise resistent sind. Der immunogene Zelltod bewirkt einen Tumorvakzine-Effekt mit der Induktion von Tumor-spezifischen T-Zellen. Stimulation der Tumorzellen mit RIG-I Liganden führt auch zur Sekretion von immunogenen Exosomen, die neben dem RIG-I Stimulus auch Tumorantigene in myeloide dendritische Zellen transferieren und eine adaptive Immunantwort gegen den Tumor auslösen. Neben der direkten Wirkung auf die Tumorzellen werden über RIG-I auch direkt Immunzellen aktiviert, was zu einer potenten T-Zell [37] und NK-Zell-Antwort führt.

Beim Design dieser therapeutischen Oligonukleotide wird über verschiedene Modifikationen der RNA einerseits eine Selektivität für den Rezeptor RIG-I erreicht, andererseits wird das Oligonukleotid gegenüber Nuklease-Abbau stabilisiert. Die Triphosphat-Gruppe der Oligonukleotide erfordert ein besonderes chemisches Syntheseverfahren [38], [39]. Solche Oligonukleotide wurden von uns etabliert, und derzeit von der Biotech Firma Rigontec GmbH klinisch entwickelt. Die erste klinische Studie zur Therapie von Patienten mit soliden Tumoren ist für das erste Quartal 2017 vorgesehen. Durch die Selektivität für RIG-I besteht ein sehr günstiges Toxizitätsprofil, das sowohl eine lokale Applikationsform als auch eine systemische Verabreichung erlaubt. Im Rahmen der klinischen Entwicklung wurden auch Analyseverfahren entwickelt, die über den Einsatz der Massenspektrometrie (LC-MS) eine Bestimmung der Konzentration des Oligonukleotids und dessen Abbauprodukte im Blut erlaubt. Mit der Zulassung von Oligonukleotid-basierten Therapieverfahren werden solche Analyseverfahren in der Zukunft auch im Sinne eines therapeutischen drug monitoring in der Laboratoriumsmedizin Eingang finden.

Insgesamt stellen diese und andere Oligonukleotid-basierte therapeutische Ansätze wie beispielsweise Antisense-Oligonukleotide [40] ganz neue Anforderungen an eine begleitende analytische Nukleinsäure-Diagnostik in Geweben und Körperflüssigkeiten. Eine Auswahl an aktuellen klinischen Entwicklungen, die Rezeptoren der Immunerkennung von Nukleinsäuren ansteuern, ist in Tabelle 1 zusammengestellt [24]. Damit eröffnet sich mit dem aktuellen Wissen um die Nukleinsäure-Immunität und um die neuen therapeutischen Ansätze ein ganz neues diagnostisches Arbeitsfeld. Dabei ist, wie eingangs erläutert, das Feld der Nuleinsäure-Immunität nur ein Beispiel für eine Reihe von neuen Anwendungen, die sich für die Nukleinsäure-Diagnostik im Blut für die Zukunft abzeichnen.