El recuento automatizado de células en líquidos biológicos: una revisión

Analizadores Sysmex (Roche Diagnostics)

Diferentes series de los analizadores hematológicos Sysmex, comercializados en España por Roche Diagnostics, disponen de un módulo dedicado (“XN-BF mode”), aprobado por la Food and Drug Administration (FDA), para el recuento de células en diferentes líquidos biológicos, y que utiliza la citometría de flujo con fluorescencia para el TNC-BF y WBC-BF y la impedancia para el RBC-BF. Desde los años 2011 y 2015, respectivamente, se comercializan las series XN y XN-L, aunque son numerosos los estudios realizados con analizadores de las series XT y XE, disponibles todavía en muchos laboratorios [8], [9], [10]. Aquellos, además del TNC-BF, WBC-BF y RBC-BF, proporcionan el PMN-BF y MN-BF y, como parámetros de investigación, entendidos como aquellos parámetros informados por el analizador pero no validados para su uso clínico, el recuento de neutrófilos (NE-BF), eosinófilos (EO-BF), linfocitos (LY-BF), monocitos (MO-BF) y células de alta fluorescencia o “HF-cells” (HF-BF), además de un RBC-BF con mayor sensibilidad analítica. Estos analizadores permiten disminuir el tiempo de respuesta de laboratorio, requieren un bajo volumen de espécimen (88 μL para la serie XN y 70 μL para la serie XN-L), disponen de material de control de calidad para el módulo de líquidos biológicos, no requieren del tratamiento previo de la muestra, excepto en el caso del líquido sinovial [11], disponen de un sistema de alarma para la presencia de células atípicas, útil como criterio para la revisión mediante microscopía óptica, presentan un límite de cuantificación adecuado para el recuento en líquidos de baja celularidad, como el LCR, y proporcionan un recuento diferencial con cuatro poblaciones, cuya transferibilidad ha sido recientemente evaluada [12].

Diversos estudios de evaluación de los analizadores de la serie XN y XN-L han confirmado su utilidad como una alternativa práctica y fiable al recuento manual [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Aunque algunos estudios describen una tendencia a la sobreestimación del recuento de algunas poblaciones celulares [13], [15], estas diferencias no son clínicamente significativas, dado el alto grado de acuerdo (95%) del recuento de leucocitos obtenido por ambos métodos para la clasificación de los líquidos [15], siendo el grado de concordancia entre ambos métodos superior en muestras con baja celularidad [8], [15]. Un estudio reciente evaluando la utilidad de estos analizadores para el estudio de la celularidad en líquidos pericárdicos obtenidos en pacientes sometidos a cirugía cardiaca ha confirmado su valor para el recuento de células totales, pero cuestiona su utilización para el recuento diferencial, dada la falta de transferibilidad de los resultados, que los autores atribuyen a la composición peculiar de este líquido, en comparación con otros líquidos serosos, con un elevado porcentaje de células mesoteliales, con tendencia a agregarse; por ello, los autores recomiendan la microscopía óptica como el método más fiable para su estudio [18].

Respecto a la imprecisión, diversos estudios [11], [15], utilizando muestras de LCR, han reportado una imprecisión en equipos de la serie XN inferior al 20%, criterio recomendado para este tipo de ensayo [19], [20] para WBC-BF, TNC-BF, PMN-BF y MN-BF a bajos recuentos (<10 células/μL), e inferior al 10% para recuentos más elevados. Utilizando los materiales de control específicos para el módulo de líquidos biológicos, la imprecisión para ambos niveles es inferior al 10% para el WBC-BF, PMN-BF y MN-BF [13], hallazgo también descrito en analizadores de la serie XN-L [21]. Otras características analíticas de estos analizadores se recogen en la Tabla 1.

La experiencia acumulada con estos equipos ha generado un conocimiento amplio sobre posibles interferencias en el recuento celular. Así, la presencia de levaduras puede interferir en los WBC-BF, TNC-BF y HF-BF, generando un patrón característico en el escatergrama (“blue surfboard pattern”) [22], de ahí la importancia de una revisión sistemática del mismo. Similarmente, pueden observarse falsos incrementos del WBC-BF en el LCR de pacientes oncológicos tratados con Depocyt, quimioterápico para el tratamiento de la meningitis neoplásica; en este caso, este tipo de espécimen no debe ser analizado con contadores automatizados [23].

Analizadores Advia (Siemens Healthineers)

Los analizadores Advia 2120/2120i disponen de una metodología multifluido (Unified Fluids Circuit) para el estudio del LCR. Esta tecnología permite el recuento de RBC-BF, WBC-BF y de PMN-BF, MN-BF, NEU-BF, LY-BF y MO-BF, expresados en valor absoluto y porcentaje. También disponen de una aplicación específica para líquidos biológicos, aprobada por la FDA, que proporciona los TNC-BF y RBC-BF en líquido pleural, ascítico, de diálisis peritoneal y sinovial, previamente tratado con hialuronidasa [24].

Según los datos de la aprobación por la FDA, el límite de detección de estos analizadores es adecuado para el procesamiento de los líquidos serosos, la imprecisión es inferior al 20%, incluso en rangos bajos de celularidad, el arrastre es inferior al 0,1% y los estudios de linealidad confirman que las desviaciones son inferiores al 10% en los rangos estudiados. Además, se dispone de material de control de calidad específico para líquidos biológicos. Sin embargo, son varias las limitaciones de estos analizadores:

1. El análisis del LCR requiere una dilución y pretratamiento previo de la muestra, lo que contribuye a aumentar el tiempo de respuesta de laboratorio.

2. Aunque los estudios de transferibilidad han confirmado que este equipo es una alternativa al recuento manual en los líquidos ascítico y pleural [24], [25], [26], esa no ha sido confirmada en el líquido de diálisis peritoneal [27]. Además, la correlación demostrada entre el RBC-BF utilizando este autoanalizador y el obtenido mediante citometría de flujo como técnica de referencia es baja (r=0,545) [28].

3. No dispone de un mecanismo de alarma de la presencia de células atípicas.

4. El recuento de leucocitos puede ser erróneo en LCR con RBC-BF>1500/μL [28], cifra rebajada por algunos autores hasta 250/μL [29].

Analizador BC-6800 BF (Mindray Medical International)

El analizador BC-6800 es un analizador hematológico dotado de un módulo específico, no aprobado por la FDA, para el recuento de células en LCR, líquido sinovial y líquidos serosos; recientemente, ha sido también evaluada su utilidad en el líquido de diálisis peritoneal [30]. Dicho analizador proporciona el TNC-BF, WBC-BF, MN-BF y PMN-BF, e informa como parámetros de investigación el recuento de células de alta fluorescencia (HF-BF*), de neutrófilos (Neu-BF*) y eosinófilos (Eos-BF*). El escatergrama que permite evaluar la distribución de la celularidad se muestra en la Figura 1. Este módulo realiza la cuantificación de células nucleadas mediante citometría de flujo con enfoque hidrodinámico (tecnología SF Cube) tras la lisis y tinción fluorescente de las células nucleadas, que son clasificadas en un escatergrama tridimensional de acuerdo con su complejidad interna, tamaño y contenido en ácidos nucleicos. Por otro lado, el analizador dispone de un canal para el RBC-BF en líquidos biológicos mediante impedancia.

Figura 1:

Escatergrama tridimensional característico para la diferenciación (DIFF) de las células nucleadas en el módulo para líquidos biológicos (BF mode) del analizador BC-6800.

Las células son agrupadas de acuerdo a su complejidad interna (eje SS), tamaño (eje FS) y contenido en ácidos nucleicos (eje FL).

Adaptada de https://www.mindray.com/en/product/BC-6800.html.

Sus principales ventajas son la disponibililidad de un material de control de calidad interno, el corto tiempo para el análisis (<3 minutos), el bajo volumen de muestra requerido (150 μL) y la posibilidad de procesar muestras sin pretratamiento previo.

Estudios recientes han evaluado sus características analíticas (Tabla 1) y la transferibilidad de resultados respecto al método de referencia [25], [30], [31], [32], [33], [34], [35], confirmando su utilidad en LCR [31] y en los líquidos pleural y ascítico [32]. Sin embargo, la evaluación cualitativa sistemática del escartegrama de diferenciación (DIFF) y del HF-BF* es esencial para la generación de algoritmos, como criterios para decidir la necesidad de la revisión microscópica [33]. En este sentido, Buoro et al. [32], [33] recomiendan la revisión en LCR con WBC-BF en el rango entre 4,0 y 7,0/μL, en presencia de un escatergrama DIFF anormal, que puede ser consecuencia de la presencia de microorganismos, con la consecuente repercusión diagnóstica [34], o por incrementos de la diferencia entre el TNC-BF y WBC-BF, que se traduce en el aumento del HF-BF* [31].

En líquido sinovial el recuento celular en el analizador BC-6800 puede reemplazar al análisis mediante microscopía óptica, siendo recomendable el pretratamiento del espécimen con hialuronidasa [35]. Aunque en líquido de diálisis peritoneal, el WBC-BF es transferible al recuento mediante microscopía óptica, la transferibilidad para el recuento diferencial no ha sido evaluada [30].

Hasta nuestro conocimiento, no se han publicado estudios sobre la utilidad de este analizador en el recuento celular en líquido pericárdico.

Analizadores de la serie Unicel DxH (Beckman Coulter)

Los analizadores hematológicos Unicel DxH 800/900, capaces de identificar células usando la tecnología Coulter, basada en el principio de impedancia, disponen de un módulo específico para el TNC-BF y RBC-BF en líquidos biológicos, utilidad aprobada por la FDA. Además, y como parámetros de investigación, proporcionan un recuento diferencial de las células nucleadas en dos poblaciones, PMN-BF y MN-BF. Similarmente a otros analizadores, también disponen de materiales de control de calidad específicos para este tipo de espécimen.

El estudio reciente de Cho et el. [21] ha confirmado la transferibilidad de resultados del analizador Unicel DxH 800, en comparación con la microscopía óptica, para el TNC-BF y RBC-BF en líquidos serosos y sinovial; sin embargo, en LCR sólo el TNC-BF fue transferible, pero no el RBC-BF, PMN-BF y MN-BF, con desviaciones respecto al método de referencia >20%. Además, en este tipo de líquido, el límite de detección para el TNC-BF fue de 18 células/μL, superior al límite superior de referencia (5 células/μL) recomendado como criterio para el examen microscópico de dicho espécimen [7]. Respecto a la imprecisión, para tres niveles de control, la imprecisión intraserial fue en todos los casos inferior al 10%. Otras características analíticas de este equipo se recogen en la Tabla 1.

Analizadores Cell-Dyn (Abbott Diagnostics)

Los analizadores de la serie Cell-Dyn, incluyendo CELL-DYN Saphire, son analizadores hematológicos que combina la impedancia y la óptica para el recuento celular, realizándose el recuento diferencial de leucocitos mediante la tecnología de separación por dispersión polarizada multiángulo (Multi Angle Polarized Scatter Separation, MAPSS). La limitación principal de este analizador es la no disponibilidad de una aplicación específica para el análisis de líquidos biológicos, además de no disponer de la aprobación por la FDA para este uso. El volumen de muestra requerido es de 120 μL.

A diferencia de otros analizadores hematológicos, la bibliografía publicada respecto a la utilidad de los analizadores Cell-Dyn para el recuento celular de los líquidos biológicos es escasa [25], [36], [37], [38], [39]. En el estudio de De Smet et al. [38] (Tabla 1), evaluando el modelo Sapphire e incluyendo LCR, serosos y de diálisis peritoneal, los autores recomendaron informar sólo WBC-BF y RBC-BF cuando sean superiores a 50/μL y 3000/μL, respectivamente, debido a la elevada imprecisión en recuentos celulares bajos, superior al 80% en recuentos de leucocitos <5/μL, lo que limita su uso en el LCR. Además, este mismo estudio demostró la ausencia de transferibilidad en aquellos líquidos con recuentos por debajo de los límites de cuantificación estimados, así como la incapacidad del analizador para una clasificación diferencial adecuada de los leucocitos en los líquidos serosos, probablemente debida a la clasificación como polimorfonucleares de células mesoteliales y macrófagos. La falta de transferibilidad fue confirmada por Keuren et al. [39].

Este analizador dispone de una alarma para la detección de células con morfología anormal. Un estudio más reciente ha demostrado la capacidad de Cell-Dyn Sapphire para la detección de células tumorales en líquidos serosos, dada la posibilidad de la que dispone este analizador para realizar el inmunofenotipado celular [40].

La línea de analizadores Cell-Dyn va a ser sustituida por el analizador Alinity-hq, con una aplicación específica para líquidos biológicos y cuya utilidad para el recuento de células en sangre ha sido recientemente evaluada [41]. Apenas se dispone de datos sobre su rendimiento en líquidos biológicos; no obstante, evaluaciones internas recientes apuntan a una mejora en la capacidad de detección y en la clasificación de las células, así como a una reducción del volumen requerido [42], [43].

Analizador GloCyte (Advanced Instruments Inc.)

El analizador Glocyte, recientemente aprobado por la FDA, es un instrumento que proporciona el RBC-BF y TNC-BF en LCR (Tabla 1). A diferencia de los analizadores hematológicos, esta metodología se basa en la detección de la fluorescencia emitida por las células nucleadas, mediante la tinción de los ácidos nucleicos, y los hematíes, mediante el marcaje con anticuerpos marcados con un fluorocromo, utilizando un láser semiconductor y un sistema óptico para capturar imágenes de dichas células. Presenta como ventajas principales el bajo volumen de muestra requerido (30 μL), el corto tiempo de respuesta analítico (5 minutos), la imposibilidad de contaminación por arrastre, debido al empleo de un sistema de cartuchos que impiden el contacto directo del espécimen con el instrumento, la no necesidad de calibración y la disponibilidad de materiales de control de calidad interno. Sus principales limitaciones son que es un analizador diseñado sólo para el procesamiento de LCR, así como la imposibilidad de obtener un recuento diferencial de las células nucleadas, lo que obligaría a recurrir a la metodología tradicional ante recuentos patológicos, la carencia de un sistema de alarma ante la presencia de otros tipos de células, así como el estrecho rango de medida analítica.

Los estudios publicados hasta el momento han demostrado la transferibilidad de resultados para el TNC-BF y el RBC-BF [44], [45]. Respecto a la precisión, este analizador presenta un coeficiente de variación inferior al 20%, para los recuentos de ambos tipos de células; esta precisión se mantuvo por debajo del 20% cuando se analizaron materiales de control y especímenes de pacientes con recuentos próximos a los puntos de corte con relevancia clínica [44].

Analizadores Sysmex

Los analizadores Sysmex (Sysmex España, SL) de la serie UF son analizadores de orina basados en el análisis de partículas mediante citometría de flujo con fluorescencia, clasificándose las células en base a tres propiedades: volumen, complejidad interna y contenido en ácidos nucleicos. Las versiones de este analizador (UF-1000i y UF-5000/4000) disponen de un módulo específico para el recuento de células en líquidos biológicos, aunque dicha aplicación no ha sido aprobada por la FDA. Respecto a sus principales características, según datos del proveedor, el límite de detección para ambos analizadores es de 2 leucocitos/μL y 5 hematíes/μL, respectivamente, la muestra no requiere tratamiento previo, el volumen requerido es de 600 μL, una de sus limitaciones más importantes, especialmente en el caso del LCR, y disponen de un sistema de lavado para evitar la contaminación por arrastre. Al igual que para algunos analizadores hematológicos, también se dispone de un material de control de calidad interno. Los estudios de evaluación publicados han demostrado una imprecisión interserial e intraserial para los recuentos de los diferentes tipos de células inferior al 10% y 20%, respectivamente, incluso a bajos recuentos celulares [46], [47]. Las características de estos analizadores descritas en la bibliografía [21], [46], [47], [48] se recogen en la Tabla 2. Es resaltable la variabilidad en los límites de cuantificación obtenidos en los estudios publicados sobre el analizador UF-5000, probablemente debido a diferencias en el método para su estimación.

La diferencia principal entre ambos analizadores radica en las magnitudes informadas. El analizador UF-1000i proporciona el TNC-BF, WBC-BF y RBC-BF, además de un parámetro de investigación denominado “Large cells”, que incluye células mesoteliales, macrófagos y células malignas no hematopoyéticas [46]. Este analizador no proporciona el recuento diferencial de las células nucleadas. El analizador UF-5000 proporciona el TNC-BF, WBC-BF y recuento diferencial, incluyendo células mononucleares (MN-BF) y polimorfonucleares (PMN-BF), expresadas en valor absoluto y porcentual, RBC-BF, “Epithelial cells” (EC), magnitud que incluye las células mesoteliales, y bacterias [47], cuya utilidad en la detección e identificación de estos microorganismos como predictor de la positividad del cultivo ha sido recientemente demostrada [49]. Una de las limitaciones principales es la imposibilidad del analizador para informar alarmas que sugieran la necesidad de revisión mediante microscopía óptica.

Diversos estudios han evaluado el grado de concordancia en los recuentos obtenidos con ambos analizadores y el método de referencia en cámara citométrica. En el caso del UF-1000i, Fleming et al. [48] demostraron un buen acuerdo para el RBC-BF, pero solo aceptable para el WBC-BF, de forma similar al demostrado por Buoro et al. [46] en muestras con recuentos <30 células/μL y más recientemente por Maleb et al. [50]. En estos estudios, el analizador sobreestimó el WBC-BF. Aunque el software dispone de una alarma de error para advertir de la presencia de ciertos interferentes, como lípidos, proteínas, restos celulares, bacterias, levaduras y hematíes lisados de forma incompleta, cuya agregación conduce a falsos incrementos del recuento celular, en su estudio Fleming et al. [48] describen incrementos asociados a la presencia de levaduras y bacterias, no advertidos por el equipo, y que se relacionan con la metodología utilizada para el recuento, la citometría de flujo, dado que la agregación de estos microrganismos, que contienen en su estructura pequeñas cantidades de ácidos nucleicos, generarían señales iguales a las de leucocitos y hematíes. Por ello, los autores consideran esencial la revisión sistemática del escatergrama, y en presencia de cualquier alteración detectada, recurrir siempre al análisis microscópico. En el caso del analizador UF-5000, Seghezzi et al. [47] reportaron un buen grado de acuerdo para el RBC-BF; para el TNC-BF y WBC-BF los autores describieron un ligero sesgo positivo (10/μL para WBC-BF y 8,2/μL para TNC-BF), que disminuyó a recuentos <20/μL (1,8/μL para WBC-BF y 2,5/μL para TNC-BF), aunque sin significación clínica. En el reciente estudio de Cho et al. [21] también el acuerdo entre el recuento automatizado y manual de las magnitudes del recuento diferencial de leucocitos (PMN-BF y MN-BF) fue evaluado, observándose para ambos una tendencia a infraestimar dichos recuentos.

Analizador Iris iQ200 ( Iris Diagnostics )

Los analizadores de la serie IQ 200, comercializados en España por Beckman Coulter, disponen de un módulo específico aprobado por la FDA para el TNC-BF y RBC-BF en líquidos biológicos, pero no proporciona el recuento diferencial de células nucleadas. Este analizador usa la tecnología Digital Flow Morphology, que permite la cuantificación y caracterización de las células, cuyas imágenes son individualizadas y clasificadas por el software Auto-Particle Recognition, permitiendo así la revisión y validación en pantalla y el reconocimiento de células con una morfología anormal. A diferencia de otros analizadores, este equipo requiere de dos diluciones previas del espécimen, siendo el volumen mínimo requerido, en el caso de líquidos de baja celularidad, de 200 μL para líquidos serosos y de 500 μL para LCR, lo cual puede ser una limitación el análisis de este tipo de espécimen [51], [52]. De forma similar a otros equipos, el Iris iQ200 dispone de materiales de control específicos para líquidos biológicos.

Los estudios publicados evaluando la transferibilidad de resultados en comparación con la metodología tradicional han demostrado un buen acuerdo entre ambas metodologías, incluso para TNC-BF<10 μL [51], [52], [53]. Los datos de imprecisión varían en función del estudio y las concentraciones de los especímenes o materiales de control utilizados para su evaluación; así, en el estudio de Butch et al. [53] tanto la imprecisión interserial como intraserial fue ≤10% para el RBC-BF y TNC-BF; sin embargo, en otros estudios [51], [52] los coeficientes de variación fueron superiores al 10%, e incluso más altos que los obtenidos con el recuento manual [51]. Las principales características analíticas del analizador Iris iQ200 se recogen en la Tabla 2.