Original Article

Antimicrobial resistance of Stx2e positive Escherichia coli before and after ban on antibiotic growth promoters

Kyung-Hyo Do1, Jae-Won Byun2, Wan-Kyu Lee1,*http://orcid.org/0000-0001-5087-6359
Author Information & Copyright
1College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea
2Foreign Animal Disease Division, Animal and Plant Quarantine Agency, Gimcheon 39660, Korea
*Corresponding author: Wan-kyu Lee College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 28644, Korea +82-43-261-2960, wklee@cbnu.ac.kr

© Research Institute of Veterinary Medicine, Chungbuk National University. All rights reserved.

Received: Aug 30, 2017; Revised: Sep 8, 2017; Accepted: Sep 12, 2017

Abstract

The emergence of antimicrobial resistant Escherichia (E.) coli is a major problem in pig farms. To tackle this issue, in July 2011, the Korean government banned the use of antimicrobials for growth promotion of animals in farms. Moreover, E. coli encoding the Stx2e gene cause edema disease which results in high mortality and morbidity in pig farms. Therefore, the aim of this study was to investigate the prevalence of antimicrobial resistance among E. coli encoding the Stx2e gene isolated from weaned piglets with diarrhea before and after the ban on antibiotic growth promoters (AGPs) in Korea from 2007 to 2016. In this period, 479 E. coli isolates were obtained from weaned piglets with diarrhea, and of them, 144 E. coli isolates encoding the Stx2e gene were detected by polymerase chain reaction. The susceptibility of the E. coli isolates to antibiotics were tested using the standard Kirby-Bauer disk diffusion method. The most frequently observed resistances in isolates obtained from weaned piglets in the last 10 years were to tetracycline (92.4%) and chloramphenicol (88.9%). The prevalence of resistance to colistin (3.1% to 16.5%) and tetracycline (86.2% to 97.5%) was also observed to have increased over this period. Additionally, multi-drug resistance was also found to have increased (87.7% to 97.5%) after the ban on AGPs. These findings provide useful data for designing prevention and treatment strategies for postweaning diarrhea and edema disease, and can be used in future studies on antimicrobial resistance in Korea.

Keywords: Antimicrobial resistance; Escherichia coli; Stx2e; Edema disease; Weaned piglets

Introduction

이유자돈은 이유 후에 모체이행항체의 저하 및 사양환경조 건의 변화 등 많은 복합적인 요인으로 인해 질병에 취약해 진다 [1]. 이유자돈에서 특히 큰 피해를 입히는 질병은 대 장균 감염증(colibacillosis)이며, 그 중에서도 이유자돈 설 사증(postweaning diarrhea)과 부종병(edema disease)이 잘 알려져 있다. 이유자돈 설사증과 부종병은 설사, 발육지 연 및 높은 폐사율로 양돈 농가에 큰 경제적 피해를 입히는 중요한 질병이다 [2]. 대장균[Escherichia (E.) coli]은 이유자 돈의 장내에 서식하는 미생물로써 그들이 갖는 병원성 인자 (adhesin, toxin gene 등)에 따라 enterotoxigenic E. coli (ETEC), Shiga toxin producing E. coli (STEC)와 같은 여 러 병형(pathotype)으로 분류된다 [3].

Verocytotoxin producing E. coli라고도 불리는 STEC는 부종병의 원인체로 알려져 있으며, 전신 혈관에 손상을 입히 는 독소인 Shiga toxin (Verocytotoxin)을 생성한다 [4]. Shiga toxin은 단량체인 A subunit과 오량체인 B subunit으 로 이루어진 58~70 kDa 분자량의 복합단백질이다. B subunit은 세포 수용체인 globotetraosylceramide와 결합, 세 포독성의 특이성, 세포 외 정착성 및 항체 형성 등에 관여하 며, A subunit은 세포 내에서 리보솜에 작용하여 단백질 합 성을 저해하는 것으로 알려져 있다 [5]. Shiga toxin은 크 게 VT1과 VT2 그룹으로 나뉘는데, VT2는 VT2e, VT2c, VT2d로 구성된다. 이 중에서 VT2e라고도 불리는 Stx2e는 돼지 혈관 내피 세포에 특징적으로 활성을 갖고 있기 때문 에 부종병의 발생에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 잘 알 려져 있다 [6].

항생제(antibiotics)는 그동안 양돈산업에서 질병을 치료하 고 예방하는 데 매우 중요한 역할을 해왔으며 [7], 특히 이유 자돈 설사증이나 부종병의 치료 및 예방법으로 사료 첨가 항 생제를 양돈산업에서 많이 사용하였다. 그러나 사료 첨가 항 생제의 광범위하고 무분별한 사용은 내성균의 출현, 특히 다 제 내성균의 출현빈도를 증가시킴으로써 양돈질병의 치료 및 예방에 심각한 문제를 일으키고 있다 [8]. 또한 사료 첨가 항 생제의 오남용은 식육 내 항생제의 잔류 등을 초래하여 공중 보건학적으로도 중요한 문제점으로 여겨지고 있다 [9]. 따 라서 질병 치료의 목적이 아닌 항생제 사용을 유럽 연합에서 는 1986년 스웨덴을 시작으로 2006년에 모두 금지하였으 며, 국내에서는 2011년 7월 배합사료 내 항생제 첨가를 전 면금지하게 되었다.

항생제 내성의 변화는 사용되는 항생제의 종류, 조사시기, 지역 등에 따라 다양하게 나타날 수 있기 때문에 항생제의 효율적인 사용을 위해서는 항생제 내성의 분포 양상을 조사 하는 것이 중요하다고 할 수 있다. 따라서 덴마크 [10], 일 본 [11], 캐나다 [12] 등 선진국에서는 국가 차원에서 병원 성 세균에 대한 항생제 내성을 조사하고 있으며 국내에서도 2003년부터 농림축산검역본부를 주축으로 지속해서 항생 제 내성을 전국적으로 조사해 오고 있다.

그동안 국내 양돈장에서 분리한 비병원성 및 병원성 대장균 의 항생제 내성에 대해서는 많은 연구가 있었지만, 배합사료 내 항생제 첨가 금지를 전후하여 병원성 대장균, 특히 부종 병 유발 Stx2e 유전자 보유 대장균에 대한 항생제 내성 변화 에 대한 연구는 찾아볼 수 없는 상황이다. 따라서 이번 연구 에서는 2007년부터 2016년까지 설사증을 나타내는 이유자 돈에서 분리한 대장균 중에서 Stx2e 유전자를 갖는 대장균 144 균주를 선발하여 배합사료 내 항생제 첨가 금지 시기인 2011년을 전후한 항생제 내성 변화를 비교하였다.

Materials and Methods

대장균 분리

2007년부터 2016년까지 설사 증상을 보이는 이유자돈으 로부터 대장균을 분리하였다. 분변 또는 장 내용물을 무균 적으로 채취한 후, 즉시 맥콩키(Becton Dickinson, MD, USA)와 혈액(Asan Co., Asan, Korea)배지에 도말하고 37℃에서 하루 동안 배양하였다. 각 배지에서 전형적인 대장 균의 모양을 나타내는 집락을 선별한 후, VITEK Ⅱ system (bioMéreiux, Marcy I’Etoile, France)을 이용하여 동정 하였다. 선별된 균주들은 추후 실험을 위하여 50% glycerol 에 넣어 -70℃에서 보관하였다.

Stx2e 유전자의 검출

분리한 대장균에 대해 중합효소연쇄반응법(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하여 Stx2e 유전자의 존재 유 무를 검사하였다. 유전자를 검출하기 위한 primer 정보 및 PCR 조건은 기존의 방법에 따라 실시하였다. 배양된 집락 을 200 μL의 증류수에 현탁한 뒤 100℃에서 10분간 가열 한 후 8,000 × g에서 원심분리하여 그 상층액을 취해 PCR 의 template로 사용하였다. PCR mixture의 조건은 2 × EmeraldAmp Master Mix (Takara Bio, Otsu, Japan)와 2 μM의 각각의 primer, 그리고 3 μL의 DNA template를 첨가하여 최종 용량이 20 μL가 되도록 하여 PCR을 수행하 였다. 증폭산물은 ethidium bromide를 첨가한 2% agarose gel 상에서 전기영동하여 확인하였다 [13].

항생제 감수성 검사

항생제 감수성 검사는 Kirby-Bauer의 방법에 따라 디 스크 확산법으로 실시하였다 [14]. 항생제는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidance를 참 고하여 다음의 16가지를 실험에 사용하였다: gentamicin (10 μg), streptomycin (10 μg), neomycin (30 μg), cephalothin (30 μg), cefazolin (30 μg), cefepime (30 μg), cefoxitin (30 μg), nalidixic acid (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), norfloxacin (10 μg), ampicillin (10 μg), amoxicillin / clavulanic acid (20 / 10 μg), trimethoprim / sulfamethoxazole (23.75 / 1.25 μg), chloramphenicol (30 μg), colistin (10 μg), tetracycline (30 μg). 각 항생제 디스크는 Becton Dickinson 사(BD)에서 판매하 는 BBL-Sensi-Disk를 구입하여 사용하였다. Stx2e 유전 자 양성 대장균을 Müeller-Hinton broth medium (BD) 에 37℃에서 하룻밤 배양한 후 멸균된 증류수를 이용하여 탁도를 McFarland Standard No. 0.5가 되도록 조정한 뒤 Müeller-Hinton agar (BD)에 도말하였다. 37℃에서 18시 간 배양한 다음 항생제 디스크 주위의 억제환의 직경을 측정 하여 Becton Dickinson 사의 매뉴얼에 따라 내성 여부를 판 정하였다. 다제 내성은 Magiorakos의 기준에 따라 3개 이 상의 CLSI subclass에 내성을 나타낸 균주를 다제 내성균 으로 간주하였다 [15].

통계적 분석

통계 분석은 SPSS 버전 12.0 프로그램(SPSS, Chicago, Illinois, USA)을 이용하였다. 사료 첨가 항생제 금지 전후 의 각 항생제에 대한 내성률을 분석하기 위하여 chi square test를 실시하였고 통계적 유의수준은 p<0.05로 설정하였 다.

Results

Stx2e 유전자 보유 대장균의 항생제 내성률

2007년부터 2016년까지 설사증이 있는 이유자돈에서 대 장균 479 균주를 분리하였으며, 그 중에서 Stx2e gene을 가 지고 있는 대장균 144 균주를 선발하였다. 항생제 내성률을 측정한 결과, Table 1에서와 같이 Tetracycline (92.4%), Chloramphenicol (88.9%), Ampicillin (86.1%), Streptomycin (79.2%), Neomycin (69.4%), Nalidixic acid (66.0%)에서 높은 내성을 나타내었다. 한편, Colistin (10.4%), Cefoxitin (25.0%), Cefazolin (30.6%)은 낮은 내성을 나타내었으며, 특히 Cefepime의 경우 지난 10년간 내성균이 전혀 검출되지 않았다.

Table1 . Antimicrobial resistance of E. coli encoding Stx2e gene isolated from weaned piglets in Korea from 2007 to 2016
Antimicrobial subclass Antimicrobial agents No. of resistant isolates (Antimicrobial resistance %)
Before1) (n = 65) After (n = 79) Total (n = 144)

Aminoglycosides Gentamicin** 46 (70.8) 34 (43.0) 80 (55.6)
Streptomycin 47 (72.3) 67 (84.8) 114 (79.2)
Neomycin 51 (78.5) 49 (62.0) 100 (69.4)
Cephalosporin I Cephalothin 41 (63.1) 41 (51.9) 82 (56.9)
Cefazolin** 28 (43.1) 16 (20.3) 44 (30.6)
Cephalosporin IV Cefepime -2) - -
Cephamycin Cefoxitin** 26 (40.0) 10 (12.7) 36 (25.0)
Quinolones Nalidixic acid 48 (73.8) 47 (59.5) 95 (66.0)
Fluoroquinolone Ciprofloxacin** 37 (56.9) 27 (34.2) 64 (44.4)
Norfloxacin** 37 (56.9) 24 (30.4) 61 (42.4)
Aminopenicillin Ampicillin 53 (81.5) 71 (89.9) 124 (86.1)
β-Lactam / β-lactamase-inhibitor combination Amoxicillin / Clavulanic acid 34 (52.3) 45 (57.0) 79 (54.9)
Folate-pathway inhibitors Trimethoprim / Sulfamethoxazole** 46 (70.8) 36 (45.6) 81 (56.3)
Phenicols Chloramphenicol 57 (87.7) 71 (89.9) 128 (88.9)
Polymyxins Colistin** 2 ( 3.1) 13 (16.5) 15 (10.4)
Tetracyclines Tetracycline* 56 (86.2) 77 (97.5) 133 (92.4)

1) The use of antimicrobials for growth promotion in animal production has been banned since July 2011 in Korea.

2) Not detected.

* Significant difference between before and after (P<0.05).

** Significant difference between before and after (P<0.01).

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국내에서 배합사료 내 항생제 첨가가 금지된 2011년을 전 후하여 내성률의 변화를 분석한 결과, Gentamicin (70.8% → 43.0%), Cefazolin (43.1% → 20.3%), Cefoxitin (40.0% → 12.7%), Ciprofloxacin (56.9% → 34.2%), Norfloxacin (56.9% → 30.4%), 그리고 Trimethoprim / Sulfamethoxazole (70.8% → 45.6%)에서 내성률이 현저 하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 Tetracycline (86.2% → 97.5%)과 Colistin (3.1% → 16.5%)의 경우, 배합사료 내 항생제 첨가 금지 후에 오히려 내성률이 증가하 는 결과를 확인할 수 있었다.

Stx2e 유전자 보유 대장균의 다제 내성률

Stx2e 유전자를 갖고 있는 144 균주의 항생제 다제 내성 률을 분석한 결과(Table 2), 가장 많은 내성 양상은 10개의 subclass에 내성을 나타낸 패턴(21.5%)이며, 뒤이어 5~7 개의 subclass에 내성을 나타내는 패턴이 많은 빈도로 검출 되었다. 10개 subclass 내성 패턴의 경우, 배합사료 내 항생 제 첨가 금지 이전에는 33.8%나 검출되었지만, 금지 이후에 는 11.4%로 현저한 감소 추세를 나타내었다.

Table 2. Multiple resistance of E. coli encoding Stx2e gene isolated from weaned piglets in Korea from 2007 to 20161)
No. of resistance2) No. of resistant isolates (Antimicrobial resistance %)
Before3) (n = 65) After (n = 79) Total (n = 144)

0 subclass* 4 ( 6.2) -4) 4 ( 2.8)
1 subclass 1 ( 1.5) - 1 ( 0.7)
2 subclasses 3 ( 4.6) 2 ( 2.5) 5 ( 3.5)
3 subclasses 1 ( 1.5) 3 ( 3.8) 4 ( 2.8)
4 subclasses 4 ( 6.2) 9 (11.4) 13 ( 9.0)
5 subclasses 6 ( 9.2) 16 (20.3) 22 (15.3)
6 subclasses 7 (10.8) 13 (16.5) 20 (13.9)
7 subclasses 6 ( 9.2) 12 (15.2) 18 (12.5)
8 subclasses 2 ( 3.1) 8 (10.1) 10 ( 6.9)
9 subclasses 9 (13.8) 4 ( 5.1) 13 ( 9.0)
10 subclasses** 22 (33.8) 9 (11.4) 31 (21.5)
11 subclasses - 3 ( 3.8) 3 ( 2.1)

Multi-resistant* 57 (87.7) 77 (97.5) 134 (93.1)
(≥ 3 subclasses)

1) There was no isolate resistant to more than 11 antimicrobial subclasses.

2) Antimicrobial subclasses defined by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) are used.

3) The use of antimicrobials for growth promotion in animal production has been banned since July 2011 in Korea.

4) Not detected.

* Significant difference between before and after (P<0.05).

** Significant difference between before and after (P<0.01).

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검사한 12 종류의 subclass 항생제 중 3개의 subclass 이 상에 내성을 나타낸 다제 내성균 분포율은 2011년 항생제 금지 이전에는 87.7%이었지만, 금지 이후에는 97.5%로 그 비율이 증가하는 결과를 나타내었다. 검사한 항생제 12개의 subclass에 모두 감수성을 나타낸 균주(0 subclass)는 지 난 10년간 단 4균주 뿐이었으며, 이는 모두 배합사료 내 항 생제 첨가 금지 이전에 분리되었다.

Stx2e 유전자 보유 대장균의 내성 패턴

Stx2e gene을 갖는, 설사 증상을 보이는 이유자돈에서 분 리한 대장균의 항생제 내성 패턴을 Table 3에 표시하였다. 배합사료 내 항생제 첨가 금지 전후로 가장 흔히 나타나는 내성 패턴은 14종류의 항생제에 내성을 나타내는 GM-SN- CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXTC- TE이었으며, 사료 첨가 항생제 금지 이전에는 65균주 중 21균주가 검출되었지만 금지 이후에는 79균주 중 단 5균 주만이 검출되어 현저한 감소 결과를 나타내었다. 또한, 사료 첨가 항생제 금지 이전에 존재했던 내성 패턴들은 금지 이후 에 사라지는 경향을 보였으며, 금지 이후에는 새롭게 출현한 내성 패턴들이 다수 관찰되었다.

Table 3. Antimicrobial resistance patterns of E. coli encoding Stx2e gene isolated from weaned piglets in Korea from 2007 to 2016
No.1) Antimicrobial resistance patterns No. of isolates
Before3) (n = 65) After (n = 79) Total (n = 144)
0 - 4 - 4

1 GM 1 - 1

2 C-TE 2 - 2
N-NA 1 - 1
N-TE - 1 1
S-TE - 1 1

3 N-AM-C 1 - 1
S-C-TE - 1 1

4 N-AM-AMC-TE - 2 2
N-AM-C-TE 1 - 1
S-AM-C-TE 1 3 4
S-C-CL-TE - 1 1
S-N-NA-AMC - 1 1

5 GM-CF-AM-C-TE 1 - 1
GM-S-AM-C-TE 1 - 1
GM-S-N-NA-TE - 1 1
NA-AM-AMC-C-TE 1 - 1
S-AM-AMC-C-TE - 1 1
S-AM-SXT-C-TE - 1 1
S-CF-AMC-C-TE - 1 1
S-CF-AM-C-TE - 1 1
S-NA-AM-C-TE - 1 1
S-N-AM-C-TE - 1 1
S-N-CF-AM-TE - 1 1
S-N-CIP-AM-TE - 1 1

6 GM-AM-AMC-SXT-C-TE - 2 2
GM-N-NA-AM-C-TE - 1 1
GM-S-N-NA-AMC-TE 1 - 1
N-CIP-NOR-SXT-C-TE - 1 1
S-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
S-NA-AM-SXT-C-TE - 1 1
S-NA-CIP-AM-C-TE - 1 1
S-N-AM-AMC-C-TE - 2 2
S-N-AM-SXT-C-TE 1 2 3
S-N-CF-AM-C-TE 1 1 2

7 CF-NA-AM-AMC-SXT-C-TE 1 - 1
CF-NA-CIP-AM-AMC-SXT-TE 1 - 1
GM-NA-AM-SXT-C-CL-TE - 1 1
GM-N-NA-AM-AMC-C-TE - 1 1
GM-S-N-AM-AMC-C-TE - 1 1
GM-S-N-AM-SXT-C-TE 1 1 2
GM-S-N-CF-AM-C-TE - 1 1
GM-S-N-NA-AM-AMC-C - 1 1
GM-S-N-NA-AM-C-TE 1 - 1
N-CF-NA-AM-SXT-C-TE - 1 1
N-NA-CIP-NOR-SXT-C-TE 1 - 1
S-NA-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
S-N-CF-AM-AMC-C-TE - 2 2
S-N-CF-NA-AM-C-TE - 1 1
S-N-NA-AM-AMC-C-TE - 1 1
S-N-NA-AM-SXT-C-TE 1 - 1

8 GM-N-NA-CIP-NOR-SXT-C-TE 1 - 1
GM-S-N-AM-AMC-C-CL-TE - 1 1
GM-S-N-CF-AM-AMC-C-TE - 1 1
GM-S-N-CF-AM-SXT-C-TE 1 - 1
GM-S-N-CF-NA-AM-C-TE - 1 1
GM-S-N-NA-AM-SXT-C-TE 3 - 3
S-CF-CZ-NA-AM-SXT-C-TE - 1 1
S-CF-NA-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
S-N-CF-AM-AMC-C-CL-TE - 1 1
S-N-CF-AM-SXT-C-CL-TE 1 - 1
S-N-CF-NA-AM-SXT-C-TE - 2 2

9 GM-CF-NA-NOR-AM-SXT-C-CL-TE 1 - 1
GM-S-N-CF-NA-AM-AMC-C-TE - 1 1
GM-S-N-CF-NA-AM-SXT-C-TE 1 - 1
S-CF-NA-AM-AMC-SXT-C-CL-TE - 1 1
S-CF-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-TE - 1 1
S-N-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-TE - 1 1

10 GM-S-N-CF-CZ-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
GM-S-N-CF-NA-AM-AMC-C-CL-TE - 1 1
GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-SXT-C-TE 1 - 1
GM-S-N-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-TE - 1 1
GM-S-N-NA-CIP-NOR-AM-SXT-C-TE 1 1 2
S-CF-CZ-NA-CIP-NOR-AM-SXT-C-TE - 1 1
S-CF-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
S-N-CF-CZ-NA-CIP-AM-SXT-C-TE - 1 1

11 GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-TE - 3 3
GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-AM-SXT-C-TE 2 - 2

12 GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-CL-TE - 1 1
GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE 2 - 2
GM-S-N-CF-NA-CIP-NOR-AM-SXT-C-CL-TE - 1 1
N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE 1 - 1

13 GM-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
GM-S-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE - 1 1
GM-S-CF-CZ-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-CL-TE - 2 2
GM-S-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-C-TE 2 - 2
GM-S-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C 2 - 2
GM-S-N-CF-CZ-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE 2 - 2
S-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-CL-TE - 1 1

14 GM-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-CL-TE - 1 1
GM-S-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-TE 21 5 26

15 GM-S-N-CF-CZ-FOX-NA-CIP-NOR-AM-AMC-SXT-C-CL-TE - 1 1

GM: gentamicin, S: streptomycin, N: neomycin, CF: cephalothin, CZ: cefazolin, FEP: cefepime, FOX: cefoxitin, NA: nalidixic acid, CIP: ciprofloxacin, NOR: norfloxacin, AM: ampicillin, AMC: amoxicillin / clavulanic acid, SXT: trimethoprim / sulfamethoxazole, C: chloramphenicol, CL: colistin, TE: tetracycline

1) No. of antimicrobials which is resistant to E. coli encoding Stx2e gene

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Discussion

본 연구에서는 2007년부터 2016년까지 설사증을 보이는 이유자돈에서 479 균주의 대장균을 분리하였으며, 그 중 Stx2e 유전자를 갖는 144개 균주에 대해 항생제 내성을 조 사하고, 배합사료 내 항생제 첨가 금지 전후의 항생제 내성 결과를 비교하였다. 국내에서 지난 10년간 분리한 Stx2e 유전자 양성 대장균은 Tetracycline (92.4%), Chloramphenicol (88.9%), Ampicillin (86.1%) 및 Streptomycin (79.2%) 등에 대해 높은 저항성을 나타냈으며, 이와 같은 결과는 덴마크, 캐나다, 일본의 모니터링 결과와 유사하였 다.

지난 10년간의 내성률을 항생제 별로 비교한 결과, 그동안 오랜 기간 많은 양으로 사용해 온 Tetracycline, Chloramphenicol, Ampicillin, Streptomycin 등이 다른 항생제에 비해 높은 내성률을 나타내었다. 이와 같은 결과는 국내의 다 른 연구 결과에서도 보고되었는데, 조 등 [16]은 2005년 돼 지에서 분리한 대장균에 대한 항생제 내성 검사 결과, Tetracycline 내성률이 97.8%로 검사 항생제 중에 가장 높았 으며, Ampicillin 내성률도 89.1%로 검사 항생제 중 두 번째 로 높은 것으로 나타났다. 비교적 최근에 보고한 임 등 [9]의 연구 결과에서도 tetracycline과 ampicillin, streptomycin 의 내성률이 각각 76.1%, 64.6%, 그리고 58.4%로 검사 항 생제 중 가장 높은 내성률을 나타냈다는 점에서 본 연구 결 과와 유사한 결과를 제시하였다. 그러나 내성률은 임 등의 연구 결과에 비해 본 연구 결과에서 더욱 높게 측정되었는데 (tetracycline: 92.4%, ampicillin: 86.1%, streptomycin: 79.2%), 이것은 균주의 유래 차이 등이 원인일 것으로 생각 된다. 한국의 국가 항생제 내성 모니터링 연구 결과에 따르 면 일반적으로 병원성 세균의 항생제 내성이 정상 가축에서 분리한 세균의 항생제 내성에 비하여 더 높게 측정되는 경향 이 있는 것으로 보고되고 있다 [17]. 본 연구에서는 설사증 의 이유자돈에서 분리한 대장균의 항생제 내성률을 측정한 반면, 임 등의 연구는 정상 가축에서 분리한 대장균의 내성 률을 측정하였기 때문으로 추측된다.

외국에서 분리한 Stx2e 양성 대장균의 항생제 내성률과 본 실험 결과를 비교한 결과, 이번 결과의 내성률이 미국 [18], 일본 [19] 등에 비하여 높게 나타나고 있었다. 그러나 Tetracycline의 경우는 미국에서도 약 71%가 내성을 나타내었 으며, 일본도 약 85%를 기록하며 본 연구 결과와 유사한 경 향을 나타내었다. 덴마크 [10], 일본 [11], 캐나다 [12]의 정상 가축에서 분리한 대장균의 항생제 내성률과 결과를 비 교한 경우에는 유사한 결과를 확인할 수 있었다.

배합사료 내 항생제 첨가 금지 전후의 항생제 내성률을 비교 하였을 때, gentamicin, cefazolin, cefoxitin, ciprofloxacin, norfloxacin, 그리고 trimethoprim / sulfamethoxazole은 금지 전에 비해 금지 후에 유의적으로 내성률이 감소 하였음을 확인할 수 있었다. 사료 첨가 항생제 금지 전후의 국내 동물용 항생제 판매량을 조사한 결과, aminoglycoside 계 항생제는 2008년 73톤에서 2016년 48톤으로 판매량이 약 25톤 감소하였으며, quinolones 계 항생제의 판매량은 51톤에서 46톤으로, sulfonamides는 15톤에서 9톤으로 감 소하였다 [17]. 이들 항생제의 내성률 감소는 항생제 판매량 의 감소와 관련이 있을 것으로 생각되는데 Dewulf 등 [20] 도 돼지에서 분리한 대장균의 항생제 내성률과 사용량 사이 에는 연관성이 있을 것으로 보고하고 있다.

본 실험에서 tetracycline의 내성률 경향을 분석한 결과, 배 합사료 내 항생제 첨가 금지 전의 86.2%에 비해 금지 후에 97.5%로 내성률이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있 었다. 이 기간 동안 tetracycline계 항생제 국내 판매량을 조사한 결과, 2008-2010년 평균 판매량은 347 톤이었으 나 2012-2016년 평균 판매량은 253톤으로 약 94톤 감소 하였다. 따라서 tetracycline 내성률의 증가 원인은 항생제 사용 외에도 다른 요인이 관여하는 것으로 추측된다. 임 등 은 국내 가축 분변에서 분리한 대장균의 내성 양상을 분석 한 결과, streptomycin, ampicillin 등 대부분의 항생제 내 성이 tetracycline과 함께 관찰되는 것으로 보고하고 있으며 [9,21,22], 이러한 내성 패턴은 미국의 연구 결과에서도 보 고되고 있다 [23]. 그러므로 tetracycline의 내성 패턴 결과 를 미루어 볼 때, 다른 항생제 사용으로 인한 항생제 내성 획 득 시 인접한 tetracycline 내성 유전자를 함께 획득할 가능 성이 있는 것으로도 생각된다 [24].

WHO에서는 사람에서 의학적인 중요도에 따라 항생제의 감수성을 확보하기 위하여 항생제를 CIA (critically important antimicrobials), HIA (highly important antimicrobials), IA (important antimicrobials) 그룹으로 분류 하고 있다 [25]. 이 중 CIA는 우선적으로 중요한 관리가 필 요한 항생제로 분류되며, fluoroquinolone계, 제 3, 4세대 cephalosporin계, macrolide계 항생제가 포함된다 [25]. Fluoroquinolone계 항생제인 ciprofloxacin (56.9% → 34.2%)과 norfloxacin (56.9% → 30.4%)에 대한 내성률 은 사료 첨가 항생제 금지 전에 비해 금지 후에 낮아졌음 을 확인할 수 있다. 그러나 아직 덴마크 (1%) [10], 일본 (2.9%) [11], 캐나다 (0%) [12]의 모니터링 결과에 비 해 높은 것으로 나타나기 때문에 내성률 관리에 주의를 기 울여야 할 필요성이 있는 것으로 보인다. Ciprofloxacin과 norfloxacin은 2008년에는 7~8톤이 판매되었으나, 2016 년에는 전혀 판매되지 않은 것을 보아 항생제의 사용이 감소 하여 내성률 또한 감소한 것으로 생각되지만 [20], 아직 선 진국과 비교하여 높은 내성률을 나타내고 있기 때문에 항생 제의 신중한 사용 등 사용에 대한 관리를 통해 내성 관리를 할 필요가 있다고 생각된다.

국내외의 연구 결과, colistin의 내성률은 높지 않은 것으 로 보고되고 있다 [10,12,17,23,26]. 이번 연구 결과에서 colistin의 내성률은 평균 10.4%로서 금지 이전의 3.1%에 비해 금지 이후에는 16.5%의 내성률로 크게 증가하였음을 확인할 수 있다. Colistin은 aminoglycosides계 항생제와 함께 ED의 치료제로 추천되는 약물이기 때문에 [2], 향후 부종병의 새로운 치료제 선정에 많은 노력이 필요할 것으로 생각된다.

사료 첨가 항생제 금지 전후를 기점으로 Stx2e 양성 대장균 의 항생제에 대한 내성을 비교한 결과, colistin에 대한 내성 은 3.1%에서 16.5%로, tetracycline에 대한 내성은 86.2% 에서 97.5%로 증가하였음을 확인할 수 있었다. Colistin과 tetracycline은 돼지 부종병의 치료뿐만 아니라 다른 가축 의 질병 치료에도 사용되고 있다. 따라서 이와 같은 항생제 내성균의 증가는 기존 항생제의 치료효과 감소 뿐만이 아니 라, 축산물 또는 축산환경을 통해 직간접적으로 사람에게 전 달될 수 있다는 점에서 대장균의 항생제 내성 증가는 공중 보건학적으로 중요한 문제이다 [9]. 이번 연구 결과, 설사 증상을 보이는 이유자돈에서 분리한 Stx2e 양성 대장균의 cefepime에 대한 내성은 지난 10년간 한국에서 관찰되지 않고 있으며, 이와 같은 결과는 Meng 등도 돼지에서 분리한 STEC가 cefepime에 대해 내성을 거의 나타내지 않는다는 보고와 일치하고 있다 [27]. 또한 농림축산검역본부의 항생 제 내성 조사 결과, 질병 이환 돼지에서 분리한 대장균의 경 우 ceftiofur에 대해 내성을 거의 나타내지 않는 것으로 보고 되고 있다. 따라서 cefepime과 ceftiofur는 현재 내성률이 증가하고 있는 것으로 보이는 colistin과 tetracycline을 대 체할 항생제 후보로 추천되고 있다.

본 연구결과 다제 내성균의 분포는 매우 높게 나타났다. 흥 미롭게도, 배합사료 내 항생제 첨가 금지 이전에는 모든 항 생제에 감수성을 보이는 균주가 6.2% 존재하였지만(Table 2), 금지 이후에는 모든 균주가 최소 2개의 antimicrobial subclass에 저항하는 것으로 나타났다. 세 종류 이상의 항생 제 subclass에 내성을 보이는 다제 내성균의 비율도 금지 전 87.7%에서 금지 후 오히려 97.5%로 증가하는 경향을 나타 내었다. 이와 같은 결과는 사용한 항생제의 종류가 다르므로 다제 내성률을 직접 비교하기는 어렵지만, 미국의 가축 유래 대장균에서 보고한 돼지의 다제 내성률(51.7%)에 비해서도 높은 결과이다 [15]. 이유는 명확하지 않지만 국내에서 항 생제 사료 첨가 금지 이후 돼지 대장균 감염증 등 세균성 질 병이 급증하였는데, 이와 같은 질병 치료용으로 항생제 사용 이 많이 증가하였기 때문으로 추측된다. 또한 아직 국내에서 는 항생제 사용에 대한 규제가 선진국에 비해 엄격하지 못하 기 때문에 수의사가 아닌 축산 관련 종사자 등 비전문가에 의한 항생제 사용이 많은 것도 이런 현상의 원인이 될 수 있 다고 생각된다 [9]. 그러나 10개의 antimicrobial subclass 에 저항하는 내성 패턴은 항생제 첨가 금지 이전에 비해 금 지 이후에서 유의적으로 줄어들고 있는 점이 고무적인 내 용이라고 생각된다. 이와 같은 결과는 위에서 언급한 gentamicin, cefazolin, cefoxitin, ciprofloxacin, norfloxacin, trimethoprim / sulfamethoxazole 등의 항생제에 대한 내 성이 줄어듦과 동시에 ampicillin, chloramphenicol, colistin, tetracycline 등에 대한 내성이 증가하는 항생제 내성 패턴이 변화하는 결과로도 생각된다.

본 연구에서는 2011년 항생제의 사료 첨가 금지를 전후하 여 국내 설사 이유자돈에서 분리한 Stx2e 양성 대장균의 지난 10년간 항생제 내성 경향을 분석한 결과, gentamicin, ciprofloxacin, norfloxacin, trimethoprim / sulfamethoxazole과 같은 자주 사용되었던 항생제들에 대한 내 성은 낮아진 반면, colistin과 tetracycline에 대한 내성률은 증가하였고, 다제 내성균의 비율 또한 증가하는 경향을 나타 내었다. 이와 같은 연구 결과는 대장균증 및 부종병의 예방 및 치료에 대한 기초 정보를 제공할 뿐만 아니라 향후 항생 제 내성 연구와 사용 관리에 대한 전략을 수립하는 데에 중 요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

Acknowledgements

본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술 기획평가원의 생명산업기술개발사업의 지원을 받아 연구되 었음 (114058-03-3-CG000).

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