Introduction
세포 내 칼슘 이온은 이차 메신저로서 수정, 근육 수축, 신경전달물 질 분비, 체액 분비, 세포외배출, 학습과 기억 같은 활동에 중요한 역할 을 담당한다[1,2]. 이 중 타액선에서의 타액 분비는 세포 내 칼슘 농도 ([Ca2+]i)를 조절하는 수용체들에 의해 조절된다고 알려져 있다. 주로, 타액선의 포상세포(acinar cell)와 도관세포(ductal cell)에 존재하는 M1과 M3 콜린성 수용체들의 활성에 의해 분비된 아세틸콜린이 [Ca2+]i를 증가시켜 체액 분비를 자극한다. 아드레날린성 수용체의 활성에 의해 분비된 cyclic adenosine monophosphate는 포상세포에서는 효소의 분비를 자극하고 도관세포에서는 탄산수소 이온(HCO3-) 분비를 포함하 는 체액과 전해질 운반을 조절한다. 또한, 포상세포와 도관세포에 존재 하는 퓨린성 수용체들도 [Ca2+]i의 증가에 의해 활성화되어 타액선의 분 비를 자극한다[3,4].
타액선에서의 칼슘 신호조절은 아세틸콜린과 같은 작용제가 G-단 백 결합 수용체(G protein coupled receptor, GPCR)의 G 단백에 결 합하여 phospholipase C (PLC) 활성화 후 phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate를 가수분해시켜 inositol 1,4,5-triphosphate (IP3)를 생성한다. 이렇게 생성된 IP3는 세포질그물(endoplasmic reticulum)에 있는 IP3 수용체를 활성화하여 세포질그물에 저장된 칼 슘 분비를 통해 [Ca2+]i를 증가시킨다. 이러한, 세포질그물의 칼슘 고갈 에 의해 활성화되는 저장고-의존성 칼슘 유입(store-operated Ca2+ entry)은 세포질그물 칼슘 센서인 stromal interaction molecule 1 (STIM1)과 형질막(plasma membrane)의 Orai와 transient receptor potential canonical (TRPC) 채널들이 클러스터를 형성하여 활 성화되며, 증가된 [Ca2+]i은 칼슘 배출기전을 활성화시켜 sarco/endoplasmic Ca2+-ATPase (SERCA)와 plasma membrane Ca2+- ATPase (PMCA)를 통해 세포질 밖으로 칼슘을 이동시켜 기저 수준의 [Ca2+]i로 회복된다[2-5].
이러한, GPCR 중 일부는 스캐폴드 단백인 Homer 그룹의 단백들과 결합할 수 있는 결합 모티브를 가지고 있다. Homer 그룹은 여러 개의 스플라이싱 변이들을 통해 Homer1, Homer2, Homer3로 분류된다. 이 중, 짧은 형태의 Homer1a는 신경 세포에서 지속적 자극에 의해 직 접적으로 발현되는 초기 유전자 생산물로 발견되었다[6]. Homer1a를 제외한 모든 Homer 단백들은 긴 형태를 지니고 있으며 중추신경계 전 반에 고르게 발현되어 있다. Homer 단백들은 N-말단에 Ena/VASP homology 1 (EVH1) 단백 결합 도메인과 C-말단에 coiled-coil 복합 (multimerization) 도메인과 류신 지퍼(leucine zipper)를 가지고 있으 며, 특히, EVH1 도메인은 일부 GPCR들, TRPC 채널들, IP3 수용체들, ryanodine 수용체들(RyRs), 그리고 스캐폴드 단백인 Shank 그룹 등 과 결합을 할 수 있는 곳이다[7]. Homer 단백은 신경 세포의 시냅스 활 성을 조절하는 시냅스 단백으로 알려졌으나[6,7], 이후 비활성 세포에 서의 연구들을 통해 Homer1은 TRPC 채널과 IP3 수용체들의 결합을 도와 칼슘의 유입을 조절하고[8], Homer2는 췌장의 포상세포에서 G 단백과 PLC 활성 조절을 통해 GPCR들의 칼슘 신호 유발 자극 강도를 조절하며[9], 이하선 포상세포에서는 PMCA와의 결합을 통해 [Ca2+]i를 조절 한다[10]는 것이 밝혀졌다. 또한, 골격근에서 Homer2는 근세포 분화 과정 동안 RyR을 통한 칼슘 분비를 증가시켜 nuclear factor of activated T cells type c1 (NFATc1)-의존적 신호전달경로를 활성화시키 고[11], Homer2와 Homer3가 T 림프구와 파골세포에서 calcineurin 과 경쟁적으로 NFAT에 결합하여 T 세포의 활성[12] 및 파골세포 분화 조절[13]에 관여한다.
GPCR 작용제의 생리학적 농도 자극에 의해 발생되는 칼슘 신호는 주기적으로 반복되는 칼슘 진동(oscillations)의 형태로 나타나며, 굴 모양(sinusoidal) 칼슘 진동과 기저선을 따라 극파(spike)가 발생되는 일과성(transient) 칼슘 진동으로 구분된다. 또한, 칼슘 진동의 주파수 (frequency)와 진폭(amplitude)은 수용체 자극 강도에 의해 결정된다 [14-16]. 칼슘 진동은 항상 세포의 첨단부 극(apical pole) 쪽에서 시 작하여 기저부 극(basal pole) 쪽으로 칼슘 파동(waves)의 형태로 진 행되며[17-19], 칼슘 신호전달의 기본적 측면은 유사하지만 작용제 자 극에 대한 민감도, 칼슘 진동의 주파수, 칼슘 파동의 속도 등 세부적 측 면에서 췌장 세포와 타액선 세포에서의 칼슘 신호전달은 명확하게 구분 된다[5,14,20,21]. 이러한 칼슘의 파동은 첨단부 쪽에 위치한 칼슘 신 호 구조물들과 밀접한 관련이 있는 것으로 여겨지며[22], 췌장 포상세 포의 경우 칼슘 진동의 발생이 첨단부 극 쪽으로 국한될 수 있고, 칼슘 진동은 시공간적 측면에서 세포의 종류에 따라 다르게 나타난다고 알려 져 있다[23]. 그럼에도 불구하고, 비활성 세포의 칼슘 신호 유발과정에 서 Homer 단백들의 역할은 여전히 명확히 알려져 있지 않아 본 연구 에서는 Homer2 유전자 제거(Homer2-/-) 마우스를 이용하여 이하선 포상세포에서 칼슘 신호 유발에 따른 칼슘 및 아밀라아제 분비에 대한 Homer2의 역할을 알아보고자 하였다.
Materials and Methods
1. 재료
Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2/AM)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서 bovine serum albumin (BSA)과 pyruvic acid는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다. Collagenase type IV, carbamyl choline chloride (carbachol), soybean trypsin inhibitor, N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)와 D-glucose는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
2. 실험동물
대조군과 Homer2 유전자 제거(Homer2-/-) 마우스는 선행 연구에 서 제작/사용되었던 실험동물(25–28 g)을 사용하였다[9,10]. 모든 실 험동물들은 연세대학교 치과대학 동물실에서 12시간 주/야 순환 주기 와 일정한 온도, 습도를 유지하면서 사료와 물을 자유로이 공급하며 사 육되었고, 연세대학교 실험동물 윤리위원회(IACUC 승인 번호 2010- 0211)의 윤리규정에 따라 실험하였다.
3. 이하선의 포상세포 분리
이하선의 포상세포 분리는 콜라게네이즈 분해법(collagenase digestion) 을 이용하여 선행연구에서 사용된 방법과 동일하게 실시하 였다[10]. 분리된 세포는 생리식염수(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 310 mOsm, pH 7.4 with NaOH)에 0.1% BSA와 0.02% soybean trypsin inhibitor를 첨가한 solution A에 담근 후 사용할 때까지 얼음 에 보관하였다.
4. 세포 내 칼슘 농도([Ca2+]i) 측정
[Ca2+]i의 변화를 측정하기 위하여 대조군과 Homer2-/- 마우스에 서 분리한 이하선 포상세포는 생리식염수에서 5 μM Fura-2/AM 과 0.05% pluronic F-127를 60분간 처리하였다. Fura-2의 형광 은 Molecular Devices (Downingtown, PA, USA) 이미징 시스템 을 이용하였으며, 이때 파장은 excitation 파장(340 nm와 380 nm)과 emission 파장(510 nm)을 사용하여 형광의 변화를 측정하였다(Ratio = F340/F380). Fura-2의 형광 변화 이미지들은 도립 현미경(inverted microscope, Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan)에 부착된 CCD 카메라(Teledyne Photometrics, Tucson, AZ, USA)를 통하여 컴퓨 터에서 1초 간격으로 기록하였다. 모든 실험자료의 분석은 MetaFluor software (Molecular Devices)를 이용하였다.
5. 아밀라아제 분비량 측정
실험동물은 실험 전 24시간 동안 물을 제외하고 금식시켰다. 각각의 포상세포는 세포 내 칼슘 측정 시 사용된 carbachol의 농도로 자극하 였다. 포상세포들은 60 rpm의 속도로 37℃ 진탕 배양기 안에서 20분 간 carbachol을 처리한 후 초음파기로 용해시켜 13,000 rpm의 속도 로 10분간 원심분리 후 정제되었다. 총 아밀라아제 함량 또는 배양액으 로 방출된 아밀라아제 함량은 이전 실험방법 등을 참조하여 측정하였 다[24-26]. 배양액과 homogenized 이하선 상층액을 소량 분리하여 37℃에서 10분 동안 0.5% 전분(starch)을 처리한 후 540 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 배양액 내 아밀라아제 활성도는 총활성도에 대한 백분율로 표시하였다.
6. 실험자료의 통계 분석
모든 실험자료의 수치 값은 평균값(mean) ± 표준오차(standard error, S.E.)로 표시하였다. 각 수치 값의 통계적 유의성 검증은 독립 t-test 를 시행하였으며, p ＜ 0.05에서 통계적으로 유의하다고 평가하였다.
Results
1. 작용제에 의한 세포 내 칼슘의 변화 양상
이전의 연구들에서 Homer2-/- 마우스의 췌장과 이하선 포상세포에 서 Homer2 단백 발현의 감소는 칼슘 신호 관련 단백들의 발현 변화 및 GPCR 작용제에 대한 칼슘 신호의 변화를 유발하였다[9,10]. 대조 군과 Homer2-/- 마우스의 이하선에서 분리된 포상세포에 생리학적 자 극 농도인 1.5 μM carbachol 자극에 의해 [Ca2+]i의 증가 후 기저 수 준의 [Ca2+]i로 돌아오지 않고 증가된 상태를 유지하는 굴모양 칼슘 진 동이 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 자극 이후 초기 [Ca2+]i의 변 화는 일과성 진폭(transient amplitude)으로 나타냈으며, 대조군과 Homer2-/- 마우스 모두에서 비슷하게 관찰되었다(Fig. 1B). 이러한 굴 모양 칼슘 진동은 일정한 주파수를 가지고 유발되는 반면, 진동의 진폭 은 Homer2-/- 마우스의 포상세포에서 현저히 감소되어 나타나는 것을 확인하였다(Fig. 1C). 이러한 결과들은 Homer2 단백이 [Ca2+]i의 조절 과 상관 관계가 있음을 시사한다.
2. 칼슘 의존적 아밀라아제의 분비기능 변화
Homer2 단백 발현 억제에 따른 이하선 포상세포에서의 아밀라아제 분비에 대한 영향을 조사하였다. 각 마우스의 이하선 포상세포에 1 × 10-7, 5 × 10-7, 1 × 10-6, 3 × 10-6, 1 × 10-5 M의 carbachol을 처 리한 후 아밀라아제의 분비를 측정한 결과, 대조군 마우스의 이하선 세 포에서 농도 의존적으로 아밀라아제 분비가 증가되는 것을 확인하였다. 반면, Homer2-/- 마우스의 이하선 세포에서의 아밀라아제 분비는 대조 군에 비해 현저히 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 2). 이는 [Ca2+]i 조절 에 대한 Homer2 단백의 작용이 아밀라아제 분비기능 조절에도 관여함 을 시사한다.
Discussion
본 연구는 타액 분비를 담당하는 이하선 포상세포에서 Homer2 단백 이 칼슘 신호전달과 타액 분비기능 조절에 미치는 영향을 생리학적 농 도의 작용제를 사용하여 조사하였다. Homer2 단백은 이하선 포상세포 에서 생리학적 자극 농도의 carbachol에 의해 발생된 칼슘 진동의 진폭 을 조절하며, 칼슘 신호에 영향을 받는 타액 분비, 특히 아밀라아제 분 비기능에 영향을 미치는 것을 확인하였다.
이전의 연구들에서 Homer2 단백의 발현 조절은 IP3 수용체의 발현 과 기능에는 영향을 미치지는 않지만, 췌장의 포상세포에서 SERCA2 발현을 조절하여 [Ca2+]i를 조절하고, 생리학적 자극 농도의 GPCR 작 용제 처리 시 regulators of G-protein signaling proteins (RGS)와 PLCβ의 GTPase-activating proteins의 활성 조절을 통해 자극에 대 한 민감도를 증가시킨다는 보고가 있었다[9]. 또한, 이하선의 포상세 포에는 PMCA의 C-말단에 다양한 스캐폴드 단백들이 결합할 수 있는 PDZ 도메인(PSD-95/Dlg/ZO-1 domain)이 위치하며, PDZ 도메인 과 Homer1a의 결합을 통해 PMCA의 발현 증가 및 세포 내 칼슘 제거 속도를 향상시키는 반면, PMCA의 N-말단에 위치한 EVH1 도메인의 PPXXF 유사 모티브와 Homer2가 결합하여 이러한 반응들을 억제한다 고 보고되었다[10]. 그러나, Homer2 단백의 발현과 칼슘 신호 전달에 따른 타액 분비와의 상관 관계를 직접적으로 보여준 연구 결과는 없었다.
많은 세포 유형에서 [Ca2+]i의 변화는 자극의 강도에 따라 또는 표적 단백의 세포 내 위치와 관련하여 칼슘 진동이 주파수나 진폭의 형태로 다양하게 인코딩되어 나타날 수 있다[2,27-30]. 특히, NFAT, nuclear factor-κB (NF-κB)와 같은 다양한 전사 인자들, calmodulin kinase II와 같은 칼슘-의존성 효소들, 그리고 미토콘드리아의 칼슘 진동의 민 감도 등은 칼슘 진동의 주파수로 인코딩되어 나타난다[30]. 또한, 칼 슘 파동의 진폭과 NF-κB/signal transducer and activator of transcription 3 전사 인자의 활성을 위해 필요한 [Ca2+]i의 증가 시점까지 의 칼슘 파동 지속 시간(duration)이 작용제 자극에 의한 전사와 유전 자 발현을 조절하며[27,31], [Ca2+]i과 IP3 수용체의 활성 정도에 따라 칼슘 진동의 진폭이 변화되어 나타날 수 있다[14,20,22,32]. Yang 등 [10]의 보고에 의하면 이하선의 포상세포에서 Homer2 단백 발현 억제 는 GPCR 작용제에 대한 IP3 생성, IP3 수용체의 발현과 작용에 대해 어 떠한 영향도 미치지 않았고, 고농도의 작용제 자극에 의한 [Ca2+]i의 증 가는 대조군과 비슷하였으나, 칼슘 제거 속도는 급격히 향상되었다. 이 러한 결과들은 Homer2 단백이 이하선 포상세포에서 고농도의 작용제 자극에 대한 [Ca2+]i의 증가 또는 총 칼슘 증가량에 대한 영향보다 저농 도의 작용제 자극에 대한 칼슘 신호 조절에 직접적으로 관여하여, 칼슘 신호-의존적 타액 분비에 영향을 줄 가능성이 있음을 시사한다. 반면, 췌장의 포상세포에서 GPCR 작용제의 저농도 자극에 의해 생성된 칼슘 파동은 Homer2 발현 억제에 의해 GPCR의 민감도가 증가하여 칼슘 파동의 주파수가 급격히 증가되었으며[9], RGS4 발현 억제에 의해서도 칼슘 파동의 주파수가 급격히 증가되어 아밀라아제 분비를 증가시켰다 [26]. 이러한 결과는 본 연구 결과와는 차이를 보이는데, Yang 등[10] 의 보고를 근거해서 조직 특이적 반응의 결과로 여겨진다.
비흥분성 세포들에서 외부 자극에 대한 칼슘 신호의 크기와 시공간적 변화들은 분비 작용과 밀접한 관련이 있으며, 이러한 [Ca2+]i의 증가는 IP3에 의한 세포질그물 내 칼슘 저장고에서의 칼슘 분비와 형질막의 칼 슘 채널들을 통한 칼슘 유입으로 구분된다. 특히, 세포질그물의 IP3 수 용체에 의해 [Ca2+]i 신호의 개시와 패턴이 정해지며, 세포 내 칼슘의 유 입은 저장고-의존성 칼슘 유입 기전에 의해 [Ca2+]i의 증가와 타액 분 비를 지속시키는 일을 담당한다[4,14,16,33]. 이렇게 분비 세포들은 [Ca2+]i 신호의 생성과 증폭을 미세하게 조절하며 세포의 기능을 담당하 지만, 세포의 손상이나 기능 이상, 질환 등에 의해 구강건조증이나 자가 면역 질환인 쇼그렌 증후군(Sjögren’s syndrome) 등의 질환이 발생하 게 된다. 특히, 이러한 기능 이상은 STIM1과 TRP 채널과 같은 칼슘 신 호 인자들의 발현과 기능 변화에 기인한다[33]. 이전 보고들과 함께 본 연구의 결과들을 통하여 Homer2 단백은 STIM1, TRP 채널과 같은 저 장고-의존성 칼슘 유입 기전에 의해 칼슘 신호의 활성을 조절하여 칼슘 신호전달계를 통해 타액 분비기능을 조절할 것으로 여겨진다[7,8]. 본 논문은 Homer2 단백이 직접적으로 세포 내 칼슘 신호전달 기전에 작 용함과 동시에 타액 분비기능 활성에도 관여한다는 내용을 명확히 보여 주고 있으며, 구강건조증과 같은 질병 연구에 큰 도움이 될 것으로 생각 한다.
