German Title: NMDA-Rezeptoren und ihre Beteiligung am neuronalen Zelltod - eine in-vitro Evaluation

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Abstract

Brain ischemia is one of the leading causes of death and disability in the world with enormous socioeconomic consequences annually, however to date, despite multiple studies, the only clinically available remedy is the thrombolytic tissue plasminogen activator (tPa). The development of new therapeutic interventions/strategies requires a deeper insight into the pathology, which can only come from better characterization of ischemic models and usage of appropriate parameters to evaluate neuronal damage. The usage of a right model and cell death assay is essential for an effective translation to in vivo and clinical studies. Organotypical hippocampal slice cultures offer an in vitro model to study brain ischemia by induction of oxygen and glucose deprivation (OGD). In organotypic hippocampal slice cultures the interaction between neuronal and non-neuronal cells are well preserved and intrinsic connections of the hippocampal structure are largely maintained. However, there is scant data regarding the expression and functionality of N-Methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) in such slice cultures. NMDARs, which are essential mediators of synaptic plasticity under normal physiological conditions, are during brain ischemia excessively activated due to glutamate overflow and mediate excitotoxic cell death. The aim of the first part of my thesis was thus to evaluate the expression of NR1, NR2A and NR2B and their contribution to excitotoxic cell death after exposure to NMDA or OGD in organotypical hippocampal slices cultures after 14 days in vitro (DIV14). OGD induced the typical ischemic injury damage as it is delayed and most pronounced in the hippocampus cornu ammonis (CA) 1 pyramidal neurons. This study revealed that NR1, NR2A and NR2B subunits were expressed at DIV14 and contributed to cell death, as shown by use of the NMDAR antagonist MK-801 (dizocilpine). Excitotoxic cell death induced by NMDA was antagonized by 10 μM MK-801, a dose that offered only partial protection against OGD-induced cell death. High concentrations of MK-801 (50–100 μM) were required to counteract delayed cell death (48–72 h) after OGD. The higher dose of MK-801 needed for protection against this delayed phase of OGD-induced death could not be attributed to down-regulation of NMDARs at the gene expression level. Additionally, I found that NR2B-subunits did not contribute to NMDA-or OGD-induced cell death at DIV14 and that NR2B possibly is post-translationally modified under normal physiological conditions. My data indicate that NMDAR signaling is just one of several mechanisms underlying ischemic cell death and that prospective cytoprotective therapies must be directed to multiple targets. Another important aspect to be taken in consideration in studies aimed to discover cytoprotective agents are the parameters used for evaluation. Most studies evaluate neuronal survival from nuclear damage, which reflects the final stage of cell death and lacks information about neuronal function. The aim of the second part of my thesis was to investigate more subtle changes in neurons prior to cell death by assessing dendritic damage and furthermore to characterize the functionality of these neurons using electrophysiological recordings. Dendritic damage, manifesting as focal swellings of dendrites (beadings), is an early morphological hallmark of neuronal damage and has been described in a variety of pathological conditions including brain ischemia. Protection against dendritic beading is likely to reduce later neuronal damage. NMDARs are involved in mediating also cell survival, not only cell death. Increased synaptic activity triggers Ca2+ influx via synaptic NMDAR receptors that activates a gene transcription dependent acquired neuroprotection program. Here I show that increased synaptic activity protects, in a transcription and partly nuclear calcium dependent manner, against dendritic damage. Increased synaptic activity induced gene program for acquired neuroprotection includes activating transcription factor 3 (ATF3). I show additionally that overexpression of ATF3 protects against NMDA-induced dendritic damage in line with its known protection against neuronal death. Furthermore, the protected dendrites are functional indicated by the restoration of synaptic transmission-dependent network activity within 48 h of an otherwise toxic NMDA insult. I conclude that ATF3 is a robust neuroprotective gene offering protection against acute neuronal injury and hence improving the functional outcome after neuronal damage.

Translation of abstract (German)

Die zerebrale Ischämie ist weltweit eine der führenden Krankheits- und Todesursachen mit weitreichenden sozioökonomischen Auswirkungen. Trotz vielfacher Studien gibt es jedoch bis heute nur den trombolytischen Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA) als klinisch verfügbares Heilmittel. Die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionen/Strategien verlangt ein besseres Verständnis der Pathologie, die nur durch eine bessere Charakterisierung der Ischämiemodelle und entsprechender Parameter zur Beurteilung einer neuronalen Schädigung erlangt werden kann. Die Verwendung des richtigen Modells und eine Bestimmung des Zelltods sind für eine wirksame Umsetzung in in vivo Bedingungen und klinischen Studien notwendig. Organotypische hippokampale Schnitt-Kulturen stellen ein in vitro Modell dar, um die Ischämie des Gehirns durch die Induktion des Entzugs von Sauerstoff und Glucose (OGD) zu studieren. In organotypischen hippokampalen Schnitt-Kulturen wird die Wechselwirkung zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen gut bewahrt und intrinsische Verbindungen der hippokampelen Struktur werden größtenteils aufrechterhalten. Jedoch gibt es gibt nur spärliche Daten bezüglich der Expression und der Funktionalität der N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR) in solchen Schnitt-Kulturen. NMDAR, welche unter normalen physiologischen Bedingungen die wesentlichen Vermittler der synaptischer Plastizität sind, werden während einer Ischämie des Gehirns übermäßig durch eine Glutamat-Überschwemmung aktiviert und erzeugen einen exzitotoxischen Zelltod. Das Ziel des ersten Teils meiner Arbeit befasst sich mit der Bestimmung der Expression von NR1, NR2A und NR2B und deren Beitrag zum exzitotoxischen Zelltod nach Behandlung mit NMDA oder OGD in organotypischen hippokampalen Schnitt-Kulturen nach 14 Tagen in vitro (DIV14). OGD führte zu typisch ischämischen Verletzungen, da er verzögert und am ausgeprägtesten in den pyramidalen Neuronen im Hippocampus Cornu Ammonic (CA) 1 auftritt. Diese Studie zeigte, dass durch die Verwendung des NMDAR Antagonisten MK-801 (dizocilpine), NR1-, NR2A- und NR2B-Untereinheiten an DIV14 expremiert werden und zum Zelltod beitragen. Durch NMDA verursachter exzitotoxischer Zelltod wurde mit 10 µM MK-801 antagonisiert, einer Dosierung die gegen den OGD-veranlassten Zelltod nur teilweise Schutz bot. Um einem verzögertem Zelltod (48-72 Stunden) nach OGD entgegenzuwirken waren hohe Konzentrationen von MK-801 (50-100 µM) erforderlich. Die höhere Dosierung von MK-801, welche für den Schutz für diese verzögerte Phase des OGD-induzierten Zelltodes erforderlich ist, konnte nicht einer Herunterregulation der NMDAR auf Genexpressionsebene zugeschrieben werden. Des Weiteren habe ich herausgefunden, dass NR2B-Untereinheiten nicht zu NMDA-oder OGD veranlassten Zelltod an DIV14 beitrugen und dass NR2B möglicherweise posttranslational unter normalen physiologischen Bedingungen modifiziert wird. Meine Daten deuten darauf hin, dass die NMDAR Signalwirkung nur eine von mehreren Mechanismen bei ischämischem Zelltod und zukünftigen zytoprotektive Therapien darstellt. Ein wichtiger Aspekt, der bei Studien zur Entdeckung zytoprotektiver Wirkstoffe berücksichtigt werden sollte, ist die Auswahl der Parameter die zur Evaluierung der Daten verwendet werden. Die meisten Studien bewerten das Überleben von Neuronen anhand der Schädigung des Zellkerns, welches das Endstadium des Zelltods wiederspiegelt und Informationen über die neuronalen Funktion vorenthält. Das Ziel des zweiten Teils meiner Arbeit war es anhand von dendritischen Schäden die genauere Veränderungen in Neuronen vor dem Zelltod zu untersuchen. Des Weiteren wurde die Funktionalität dieser Neurone mit Hilfe von elektrophysiologischen Messungen charakterisiert. Dendritische Schädigung, die sich als eine fokale Schwellung der Dendriten (so genannte Beadings) äußert, ist ein frühes morphologisches Kennzeichen von neuronaler Schädigung und wurde bereits in einer Reihe von pathologischen Zuständen, einschließlich der zerebralen Ischämie, beschrieben. Der Schutz vor einer fokalen Schwellung der Dendriten führt wahrscheinlich zur Reduktion späterer neuronaler Schädigung. NMDAR sind nicht nur bei Prozessen des Zelltods beteiligt, sie spielen auch bei Prozessen die zum Überleben von Zellen führen eine Rolle. Erhöhte synaptische Aktivität erzeugt Kalzium Einstrom via synaptischen NMDA Rezeptoren, wodurch ein Gen transkripionabhängiges erworbenes Neuroprotektionsprogramm aktiviert wird. Hier zeige ich, dass eine erhöhte synaptische Aktivität in einer transkriptionsabhängigen und teilweise durch nukleären Kalzium bedingten Weise gegen dendritische Schädigung schützt. Genprogramme für eine erworbene Neuroprotektion, die durch erhöhte synaptische Aktivität induziert werden, schließen die Aktivierung des Transkriptionsfaktors 3 (ATF3) mit ein. Zusätzlich zeige ich, dass eine Überexpremierung von ATF3 gegen eine NMDA-induzierte dendritische Schädigung schützt. Dies stimmt mit dem bereits bekannten Schutz gegen neuronalen Zelltod überein. Des Weiteren sind die geschützten Dendriten funktional, welches durch die Wiederherstellung der transmissionsabängigen Netzwerkaktivität innerhalb von 48 Stunden von einem ansonsten toxischen NMDA Insult angezeigt wird. Ich folgere daraus, dass ATF3 ein robustes, neuroprotektives Gen ist, welches einen Schutz gegen eine akute neuronale Verletzung bietet und somit das funktionale Ergebnis nach einer neuronalen Schädigung verbessert