A DNA method for screening hive debris for the presence of small hive beetle (Aethina tumida)

Abstract

The small hive beetle (SHB) is a parasite and scavenger of honey bee colonies. It has recently become an invasive species creating the need for an efficient and reliable detection method. We present a method to screen hive debris for the presence of SHB using real-time PCR in conjunction with an automated DNA extraction protocol. The method was able to detect DNA from SHB eggs, larvae and adult specimens collected from Africa, Australia and North America. The method was used to successfully detect SHB DNA extracted from spiked and naturally infested debris. An Apis mellifera 18S rRNA real-time PCR assay was used as an internal positive control (IPC). The IPC showed that the method was reliable for detection as extraction efficiency was consistent between hive debris samples. If the SHB were to establish at new locations, the availability of such a method would be a valuable support tool to enable species identification and rapid screening of hive debris for delimiting surveys.

Zusammenfassung

Ziel der gegenwärtigen Studie war die Entwicklung und Validierung eines schnellen Extraktionsprotokolls, das in Verbindung mit einem quantitativen PCR-Ansatz die artspezifische Erkennung des Kleinen Beutenkäfers (KBK) und seine Detektion im Stockmüll erlauben sollte. Wir gingen davon aus, dass angesichts der raschen Verbreitung des KBK ein schnelles und zuverlässiges Detektionsverfahren ein wertvolles Werkzeug in der KBK-Kontrolle darstellen könnte.

Das quantitative PCR-Verfahren wurde auf die Detektion des Cytochrom c-Oxidase I Gens von A. tumida angelegt. Zur Validierung wurden KBK-Eier, Larven und Imagines aus Afrika, Australien und Nordamerika eingesetzt. Das Verfahren wurde auch auf Kreuzreaktionen gegen die Milben Varroa destructor and Tropilaelaps clareae, sowie gegen eine Reihe an gängig in Stockmüll vorkommenden Insektenarten getestet. Es erwies sich als spezifisch für KBK und erlaubte die Detektion aller Stadien des Lebenszyklus und auch von KBK-Proben verschiedener geographischer Herkunft.

Anschliessend wurde das Verfahren auf die Erkennung von KBK in Stockmüllproben optimiert. Dazu wurde Stockmüll mit unterschiedlichen Mengen an Käfern und Larven versetzt und in Lysepuffer zermahlen. DNA wurde aus diesen Proben mittels eines automatisierten Verfahrens extrahiert, bevor die KBK-DNA-Menge dieser Proben im zuvor etablierten quantitativen PCR-Protokoll bestimmt wurde. Weitere Methodentests wurden mit natürlichen Stockmüllproben durchgeführt und mit Proben, denen KBK zugesetzt worden war. Die Ergebnisse zeigten, dass es möglich war, eine KBK-Menge von 17 mg in einer Gesamtmenge von 30 g Stockmüll zu detektieren. Die Zuverlässigkeit der Extraktionsmethode wurde ebenfalls mittels quantitativer PCR getestet, und zwar für das 18S rRNA Gen der Honigbiene, das ebenfalls aus Stockmüllproben amplifiziert werden konnte. Die C_T-Werte jedes Experiments lagen im Schwankungsbereich von je einem Zyklus, was darauf hinweist, dass die Effizienz des Extraktionsverfahrens für alle Proben ähnlich war. Die Amplifizierung des 18S rRNA-Gens stellt somit eine geeignete interne positive Kontrolle für die Stockmüllextraktion dar. Eine Verringerung der Sensitivität der PCR-Methode wurde in DNA-Proben registiert, denen Stockmüll zugesetzt worden war, was auf die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren in den DNA-Extrakten hinweist.

Wir stellen in dieser Arbeit ein Hochdurchsatzverfahren zur Detektion von KBK vor, das besonders dann von Nutzen sein kann, wenn ein KBK-Ausbruch an neuen Standorten zu verzeichnen ist. Das Verfahren kann noch weiter verfeinert werden, so dass noch grössere Probenvolumina gleichzeitig getestet werden können. Dies setzt allerdings eine weiter Validierung voraus. Die gegenwärtige Methode ist jedoch direkt einsetzbar und transferierbar für Forschungs- und Inspektions- und Überwachungsprogramme und stellt ein Mittel dar, KBK-verdächtige Stockproben zu testen.