Original article
Molecular nature of RAPD markers from Haemophilus influenzae Rd genome

https://doi.org/10.1016/S0923-2508(99)80026-6Get rights and content
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Abstract

Despite the widespread application of the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique, there is no experimental evidence of the molecular mechanism of random amplification starting from a complex template. To investigate this mechanism, we cloned and sequenced 23 selected RAPD bands amplified from Haemophilus influenzae Rd genomic DNA using eight decamer primers different in GC content and/or nucleotide sequence. As the whole genome sequence of H. influenzae Rd has been reported, the exact nucleotide sequence of each primer-template annealing site was identified. Results showed that, on an average, a homology of eight base pairs was involved in priming events and that the number of nonhomologous base pairings declined exponentially from the 5' end of the primer to its 3' end. The interaction between the primer and the template DNA was stabilized by the formation of secondary structures, and a perfect match of the 3' terminal region of the primer was not necessary for successful amplification. The complexity of the annealing process suggested that, in the studied reaction conditions, many primer-template annealing sites were extended in the first cycles and that differences in the efficiency of priming and replication processes led to amplification of RAPD fragments. Moreover, the distribution of the amplified regions on the H. influenzae chromosome was analyzed.

Résumé

Nature métabolique des marqueurs RAPD du génome de Haemophilus influenzae Rd.Malgré la généralisation de la technique RAPD (random amplified polymorphic DNA) il n'y a pas de preuve expérimentale du mécanisme moléculaire de l'amplification aléatoire à partir d'un modèle complexe. Pour explorer ce mécanisme, nous avons cloné et séquencé 23 bandes RAPD sélectionnées amplifiées à partir de l'ADN génomique de Haemophilus influenzae Rd, en utilisant huit décamères amorces différant par leur contenu en GC et/ou par leur séquence nucléotidique. Étant donné que la séquence du génome de H. influenzae est connue dans sa totalité, la séquence nucléotidique de chaque site d'annelage amorce-modèle a été identifiée. Les résultats ont montré qu'en moyenne une homologie de huit paires de bases est impliquée dans les événements d'amorçage, et que le nombre de bases non homologues s'appariant décline exponentiellement de la terminaison 5' de l'amorce à la terminaison 3'. L'interaction entre l'amorce et le modèle ADN peut être stabilisée par la formation de structures secondaires, et l'appariement de la région terminale 3' n'est pas nécessaire pour la réussite de l'amplification. La complexité du processus d'annelage suggère que, dans les conditions de la réaction étudiée, de nombreux sites d'annelage amorce-modèle sont étendus dans les premiers cycles, et ces différences dans l'efficacité d'amorçage et le processus de réplication conduisent à l'amplification de fragments RAPD. En outre, la distribution des régions amplifiées du chromosome de H. influenzae a été analysée.

Keywords

RAPD amplification
RAPD sequence
primer-template annealing site
map position

Mots-clé

amplification RAPD
séquence RAPD
site d'annelage amorce-modèle
situation cartographique

Abbreviations

nt, nucleotide
RAPD, random amplified polymorphic DNA
AP-PCR, arbitrarily primed PCR

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