MIA („melanoma inhibitory activity”) Biologische Funktionen und klinische Relevanz beim malignen Melanom

Zusammenfassung

Das Protein MIA („melanoma inhibitory activity”) wurde aufgrund seiner antiproliferativen Eigenschaften auf Melanomzellen in vitro im Zellkulturüberstand von Melanomzellen nachgewiesen und isoliert. Nachdem das Protein in der Arbeitsgruppe von Prof. Bogdahn gereinigt und ansequenziert worden war, konnte durch die Verwendung degenerierter Primer über RT-PCR ein Teil der MIA-cDNA kloniert werden. Dieses cDNA-Fragment wurde als Sonde zum Screening von Genbibliotheken verwendet, was zur Klonierung der humanen und murinen cDNA und genomischen DNA führte. Das MIA-Gen umfaßt einen Bereich von ca. 2 kb und ist in 4 Exone unterteilt. Die cDNA wird durch ein einzelnes Gen auf dem humanen Chromosom 19 bzw. auf dem murinen Chromosom 7 kodiert. Das MIA-Protein umfaßt 131 (human) bzw. 130 (murin) Aminosäuren, wovon 24 (human) – bzw. 23 (murin)-Aminosäuren eine Signalsequenz für den Transport des Proteins in den Extrazellularraum darstellen, die nach der Sekretion abgespalten werden. Reifes MIA besteht somit aus 107 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von ca. 11 kDa. Präliminäre Strukturanalysen deuten darauf hin, daß MIA ein kleines globuläres Protein ist, dessen Tertiärstruktur durch 2 Disulfidbrücken stabilisiert wird. Durch Expressionsstudien sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene konnte gezeigt werden, daß MIA in vivo und in vitro von Melanomzellen und Chondrozyten exprimiert wird. Diese sehr stark auf spezifische Zelltypen limitierte Expression wird durch den MIA-Promoter kontrolliert. Eine bedeutende klinische Relevanz kommt der Bestimmung von MIA im Serum von Melanompatienten zu, da fast alle Patienten mit metastasiertem malignem Melanom (Stadium III und IV) stark erhöhte Werte im Serum aufweisen. Durch rekombinante Expression in Bakterien konnten große Mengen an MIA synthetisiert und für Versuche sowohl in vitro als auch in vivo verwendet werden. So konnte gezeigt werden, daß MIA das spezifische Attachment von Melanomzellen an Fibronektin und Laminin in vitro inhibiert. Weitere Analysen konnten eine direkte Bindung zwischen diesen Matrixproteinen und MIA nachweisen. Eine mögliche In-vivo-Funktion von MIA könnte daher das Ablösen der Zellen aus einem Gewebeverband sein, was einen entscheidenden Schritt in der Metastasierungskaskade darstellt.

Summary

The protein MIA was identified and isolated from the tissue culture supernatant of melanoma cells in vitro by its ability to inhibit thymidine incorporation by melanoma cell lines. After purification and partial sequencing of the peptide, a fragment of the MIA cDNA was cloned by RT-PCR. This cDNA fragment was used to screen phage libraries and subsequently fully encoding human and murine MIA cDNA and genomic DNA clones were obtained. The MIA gene spans a region of approximately 2 kb and is divided into 4 exons. Mapping the MIA gene revealed that the human gene is located on chromosome 19 and the murine gene on chromosome 7. The MIA open reading frame spans 131 (human) or 130 (murine) amino acids. The first 24 (human) or 23 (murine) amino acids represent a signal sequence directing the secretion of MIA into the extracellular compartment. The mature, secreted MIA consists of 107 amino acids and its MW is approximately 11 kDa. Preliminary structural data suggests that MIA is a small globular protein stabilized by two intramolecular disulfide bonds. Expression studies of protein und mRNA levels indicate that MIA is expressed specifically by malignant melanoma cells and chondrocytes. This points to a highly restricted expression pattern which is controlled by the MIA promoter. In addition, MIA provides a clinically useful parameter in patients with malignant melanoma. Enhanced values were measured in the serum of all patients with metastatic melanoma (stage III and IV). In vitro and in vivo experiments using recombinant MIA protein revealed that MIA specifically inhibits attachment of melanoma cells to fibronectin and laminin. Further analysis indicated a direct binding between MIA and the matrix proteins. This finding provides an explanation for the capability of MIA to inhibit proliferation of melanoma cells in vitro. Our studies suggest a putative function of MIA in regulated detachment of melanoma cells from the extracellular matrix which is an important step in metastasis.